他們在原子層面看清了生命的本質
2017年的諾貝爾化學獎授予雅克·杜邦內特（Jacques Dubochet），約阿希姆·弗蘭克（Joachim Frank），以及理查德·亨德森（Richard Henderson），以表彰他們“在開發用於溶液中生物分子高分辨率結構測定的冷凍電鏡技術方面的貢獻”。這是一種呈現生物分子三維立體圖像的技術方法。使用冷凍電鏡技術，研究人員能夠將運動中的生物分子進行冷凍，並在原子層面上進行高分辨率成像。這項技術將生物化學帶入了一個嶄新時代。
圖一：過去幾年間，科學家陸續發布了多種復雜蛋白質復合體的原子結構。a。 一種控制晝夜節律的蛋白質復合體。b。 一種可感知耳中壓力變化、使我們聽到聲音的感應器。c。 寨卡病毒。
在過去的數年間，大量令人驚嘆的分子結構充斥著各類文獻（如圖一）：沙門氏菌用於侵襲細胞的註射端；導致化療以及抗生素失效的蛋白質結構圖；以及掌管生物晝夜節律的復雜分子結構等等。這裏所展示的還只不過是冷凍電鏡技術（cryo-EM）應用領域內很少的案例。當研究人員開始懷疑寨卡病毒和發生在巴西境內導致大量新生兒出現大腦損傷的“小頭癥”有關聯時，他們利用冷凍電鏡技術對病毒進行了直接成像。在短短數月內，原子層面分辨率的寨卡病毒的立體三維圖像便產生出來了，科學家們基於這些成果迅速研發相應藥物。
雅克·杜邦內特、約阿希姆·弗蘭克以及理查德·亨德森的突破性貢獻讓冷凍電鏡技術得以成為現實。這項技術將生物化學技術帶入了一個嶄新的時代，讓科學家們獲取高分辨率生物分子圖像變得前所未有的容易。
圖像是知識的載體和基礎。在20世紀上半葉，生物分子——比如說蛋白質，DNA以及RNA都是生物化學地圖上無法填充的空白區。科學家們知道這些物質在細胞內扮演著關鍵性作用，但我們無從知曉這些物質本身究竟是什麽樣的結構。直到1950年代，當英國劍橋大學的科學家們開始探索利用X射線研究蛋白質晶體結構時，這一問題才開始嶄露曙光——這是歷史上第一次，人類開始有可能將這些物質繁復纏繞的復雜結構用可視化的方式呈現出來。
到了上世紀1980年代，X射線晶體學成像方法得到了核磁共振（NMR）技術的幫助，用於研究固體狀態或者溶液中的蛋白質結構。這項技術不僅揭示蛋白質的結構，還能研究蛋白質的運動及其與其他分子之間的相互作用。正是因為有了這兩種技術的幫助，我們現在才會有囊括了數以千計生物分子模型的數據庫可以使用，這些數據庫現在被應用在從基礎研究到制藥公司的各行各業。
然而，這兩種技術都有著基礎性缺陷。對溶液內樣品使用核磁共振技術對樣品本身有限制，它只能應用於相對較小的蛋白質。而X射線晶體學方法要求必須首先將樣品制作為晶體，比如進行低溫凍結。即便如此，最終拍攝出來的圖像看上去的效果仍然就像早期相機拍出的黑白照片，科學家們很難從這些模糊不清的圖像中提取到關於蛋白質動態下的有價值信息。
另外，很多分子是很難制備成晶體樣本的，這一缺陷最終讓理查德·亨德森在1970年代下決心放棄X射線晶體學方法——而這，正是今年諾貝爾化學獎獲獎成果故事的開端。
亨德森另辟蹊徑
理查德·亨德森在英國劍橋大學獲得X射線晶體學領域的博士學位。他利用這種方法對蛋白質進行成像，但是當他嘗試對一種自然地內嵌於細胞膜上的蛋白質進行晶體制備時，卻遭遇到巨大困難。膜蛋白難以操控。它們一旦離開原有的自然環境，也就是細胞膜之後就會萎縮成一團毫無用處的物質。
理查德·亨德森嘗試成像的第一種膜蛋白難以制備足夠用量的樣本，而第二種膜蛋白則難以結晶。在經過數年的徒勞沮喪之後，亨德森開始嘗試他最後的一種“殺手鐧”——電子顯微鏡。在當時，電子顯微鏡是否真的能夠在這一領域使用仍然是一個有爭議的話題。這項技術被稱為透射電鏡，其原理或多或少與傳統的顯微鏡類似，不同的只是會有一束電子束流射向樣品，而不是傳統顯微鏡那樣是一束光線。
電子的波長遠小於光子，因此電子顯微鏡能夠分辨非常微小的結構——甚至是單個的原子。理論上講，電子顯微鏡的分辨率要滿足亨德森拍攝膜蛋白結構的需求是綽綽有余的，但是在現實中，這一目標卻幾乎是無法實現的。
當電子顯微鏡在1930年代被最早發明出來時，科學家們認為其只適合對“死的”物質進行研究。獲得高分辨率圖像所需的強烈電子束流會破壞生物材料樣品，而如果降低電子束流強度，成像質量則會大幅下降。
除此之外，電子顯微鏡需要用到真空腔，而這也不適合應用於生物分子，因為在這樣的環境下生物分子周圍的水會迅速揮發掉。而當生物分子幹涸時，它們的結構將崩塌，喪失自然結構特征，從而讓成像結果變得毫無意義。所有這一切幾乎都在告訴亨德森，他的大膽嘗試註定將要失敗。但是，他的嘗試卻由於他當時選中進行研究的蛋白質類型比較特殊而出現了轉機，他研究的對象是細菌視紫紅質。
這樣還不夠好
細菌視紫紅質是一種內嵌在光合作用有機體細胞膜上的紫色蛋白質，其能夠捕捉太陽光線中的能量。亨德森不再試圖像以前那樣將其從細胞膜上剝離，而是將其直接連同其所在的細胞膜一起放置到電子顯微鏡下進行觀察。由於該蛋白質此時仍然處於細胞膜上的自然環境下，它繼續保持著自己的自然立體結構。亨德森小組用葡萄糖溶液覆蓋樣本表面以防止其在真空腔內幹涸。
但是強大的電子束流是一個問題，不過研究組從這種蛋白質在細胞膜上內嵌方式中獲得了啟發。他們沒有采用高強度電子束流，而是使用了強度更低的束流。這樣得到的圖像對比度很差，無法分辨單個分子，但研究組利用了一個此前已知的事實，那就是這種蛋白質在細胞膜上是規整排列且朝向一致的。當所有蛋白質都發生同向衍射時，基於衍射模式計算，研究組能夠反推得到更加精細的圖像——這種方法與在X射線晶體學成像技術中使用的數學方法是類似的。
圖二：圖為1975年發布的首個細菌視紫紅質粗略模型。圖源《自然》第257期28至32頁。
下一步，研究組將細胞膜樣品再次放置到電子顯微鏡下，從很多不同的角度進行拍攝。通過這種方法，到1975年時他們已經能夠得到細菌視紫紅質的三維立體結構圖像了（圖2）。從圖像中可以清晰觀察到蛋白質鏈條是如何在細胞膜上來回穿行的。這是歷史上使用電子顯微鏡獲得的最佳蛋白質圖像。很多人對這樣的高分辨率圖像印象深刻（其圖像分辨率達到了7埃水平，相當於0.0000007毫米）。這是一個驚人的成就，但在亨德森看來，這樣的結果還不夠好。他的目標是達到X射線晶體學成像方法通常能夠達到的分辨率水平——大約3埃左右，並且他堅信利用電子顯微鏡成像技術，這個目標是可以實現的。
第一張原子層面分辨率圖像
在接下來的數年間，電子顯微鏡技術逐漸完善。鏡片質量得到了改善，低溫冷凍技術也有了新的進步。在進行觀察之前，先利用液氮對樣本進行快速冷凍，從而避免其受到電子束流的損傷。得益於這些技術進步，理查德·亨德森逐漸為他研究的細菌視紫紅質蛋白圖像加入更多細節。為了獲得最佳分辨率，亨德森遍訪世界各地最好的電子顯微鏡設備。最終，到了1990年，在他發表第一份細菌視紫紅質立體模型整整15年後，亨德森達成了自己當年許下的目標：他對外發布了分辨率達到原子層面的細菌視紫紅質立體圖像（圖三）。
圖三：1990年，亨德森發布了原子級分辨率的細菌視紫紅質結構。
通過這些工作，亨德森證明了，利用冷凍電鏡技術是可以拍攝出分辨率媲美X射線晶體學傳統方法的圖像的。這是一項重要的裏程碑。然而，這一成功有一個前提，那就是他選擇的蛋白質很特殊，細菌視紫紅質是有規則地內嵌在細胞膜上的。但是其他蛋白質卻並非如此。
這個問題很重要，因為它決定了這種方法是否具有普適性，是否能夠被推廣應用：科學家們有可能利用電子顯微鏡獲得那些分布上沒有規律的蛋白質的三維立體結構圖像嗎？亨德森堅信這個問題的答案是肯定的，而他的同行們認為亨德森的想法太過樂觀了。
與此同時，在大西洋的彼岸，紐約州衛生署，約阿希姆·弗蘭克也一直在思考著同樣的問題。在1975年，他發展出一種理論方法，能夠將電子顯微鏡獲得的二維平面模糊圖像進行分析和疊加處理，最終得到更高分辨率的三維立體圖像。但弗蘭克最終花費了超過10年時間才逐漸將這一方法一步步完善。
弗蘭克的圖像分析算法
圖四：弗蘭克生成三維結構的圖像分析法
約阿希姆·弗蘭克的方法（圖四）基本原理是讓計算機去自動分析電子顯微鏡獲得的模糊二維圖像，識別其中的蛋白質與周遭背景。他開發出一套數學方法，能夠讓計算機識別在圖像中反復出現的模式。隨後計算機將相類似的圖像模式歸類到一起並將這些圖像中的信息進行合並疊加，從而生成更加清晰的圖像。
通過這種方法，弗蘭克獲得了一系列高分辨率的二維圖像。這些圖像展示的是同一種蛋白質，但是角度不同。整套算法軟件到1981年終於完成。下一步，弗蘭克必須弄清楚這些不同角度的二維圖像之間是如何相互關聯的，基於這些信息，他要嘗試將這些二維圖像合並並構建三維立體圖像。弗蘭克在1980年代中期對外發布了部分他開發的圖像算法，並基於這一算法發布了核糖體的表面結構模型，這是一種在細胞內的細胞器，主要功能是合成蛋白質。
約阿希姆·弗蘭克的圖像處理方法對於冷凍電鏡技術的發展是基礎性的。
現在，讓我們把時間再回溯到1978年，此時的弗蘭克正忙於完善他的圖像處理算法軟件，而就在這一年，今年諾貝爾化學獎的第三位獲獎人雅克·杜邦內特被設在德國海德堡的歐洲分子生物學實驗室錄用了。杜邦內特將要解決的是電子顯微鏡領域的另外一個基礎性問題：當被放置於真空腔內時，生物樣本是如何幹涸並遭到破壞的？
杜邦內特的玻璃化方法
1984年杜邦內特首次通過玻璃水方法拍攝到樣本周圍的病毒。
在1975年，亨德森使用葡萄糖來保護樣品，防止他的細胞膜樣品幹涸。但這種方法不適用於水溶性的生物分子。其他研究者曾經嘗試冷凍樣品，因為冰的蒸發速度要比水慢，但冰的晶體結構會擾亂電子束流，導致產生的圖像是無效的。
水的蒸發問題讓人為難，然而雅克·杜邦內特卻看到了一個潛在解決方案：快速冷卻水，使其在液態形式下固化，形成一種玻璃，而不是晶體。
玻璃材料是一種固體材料，但事實上卻是液體，因為它具有混亂無序的分子排列。杜邦內特意識到，如果將水變成玻璃——也叫做“玻璃水”，電子束將均勻衍射，並提供一個標準背景。
最初，研究小組試圖在零下196攝氏度的液氮中玻璃化微小水滴，但一直沒能成功，最後用乙烷代替液氮後才最終實現，而乙烷本身則需要先用液氮來進行冷卻。在顯微鏡下，他們觀察到一種前所未見的情景。他們一開始認為這應該是乙烷，但是當液滴經過輕微加熱，其分子卻突然出現重新排列，形成了一種熟悉的晶體結構。這是一項重要的成就，因為當時很多研究人員認為不可能實現水滴的玻璃化，而現在我們認為，玻璃化的水是宇宙中最常見的水的形式。
一種簡單技術提升對比度
在1982年取得技術突破之後，杜邦內特的研究小組快速研制一種基礎性技術，該技術仍用於冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）。他們將生物樣本制成溶液——期初是不同類型的病毒。這些溶液塗抹在金屬網上形成薄膜。隨後使用一種類似彈弓的結構將其射入液態乙烷快速冷卻，從而使薄膜水玻璃化。
1984年，杜邦內特首次發布了不同病毒的結構圖像，有圓形，有六邊形。這些圖像中病毒圖像均與背景玻璃水存在清晰反差。到這裏為止，生物材料就比較容易通過電子顯微鏡進行觀察了。很快，各地的科學家們便開始前往杜邦內特的實驗室學習這項最新的技術。
從“水滴學”到大變革
冷凍電鏡最重要的問題是拍攝圖像的質量較低。1991年，約阿希姆？？弗蘭克使用杜邦內特的玻璃化方法成像核糖體，並使用自己的軟件分析這些圖像，他獲得一個分辨率為40埃的三維立體圖像。
這是電子顯微鏡領域令人振奮的一項突破，但是圖像僅能顯示核糖體輪廓。坦白地講，它更像一團色塊，分辨率上完全不能與X射線晶體學的原子級分辨率相提並論。
由於冷凍電鏡除了觀察不平整的表面之外，罕有用武之地，因此這種方法有時被嘲笑是“只能看見一坨東西的技術”（blobology）。
然而，很大程度上是由於理查德·亨德森堅信有朝一日電子顯微鏡將能夠提供原子層面分辨率的圖像並不斷進行著嘗試，電子顯微鏡技術經歷著不斷進步，它的分辨率正一埃一埃地不斷改善，最後一個障礙在2013年被成功突破——一種全新的電子顯微鏡問世了（圖六）。
洞察細胞的每個隱秘角落
現在，夢想已成現實。我們正面對生物化學領域的爆炸式發展。冷凍電鏡的諸多優勢使其具有了革命性的意義：杜邦內特的玻璃化技術使用相對容易，同時需要的樣本量較少；由於快速冷凍過程，生物分子在過程中凍結，研究人員拍攝一系列圖像，能夠捕捉到該進程的不同部分。
通過這種方式，研究人員能夠制作出一段段的“影片”，記錄下蛋白質的運動，以及它們與其他分子之間相互作用的動態過程。借助冷凍電鏡技術，分析細胞膜蛋白質結構變得前所未有的容易，而這些蛋白質往往與制藥技術緊密相關，對於超大型分子團也是同樣如此。不過，小型蛋白質仍然無法使用電子顯微鏡進行研究，但它們可以借助傳統的X射線晶體學方法以及核磁成像技術進行研究。約阿希姆?弗蘭克在1975年提出他的圖像算法之後，一名研究人員曾經這樣寫道：“如果這種方法能夠被最終完善，那麽，用一位科學家的話來說，其前景將是一片坦途，無所阻礙。”
現在，海闊任魚躍，天高任鳥飛——雅克?杜邦內特、約阿希姆?弗蘭克和理查德?亨德森所研發的這項技術將帶給人類最大的益處。我們將能夠以原子層面的分辨率洞察細胞的每一個隱秘角落，生物化學將迎來一個光輝的未來！（晨風，悠悠）
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