Real-time qPCR So Easy?

【2016-05-27】      

 

實時熒光定量PCR技術是在定性RCR技術基礎上發展起來的核酸定量技術，於1996年由美國Applied biosystems公司推出。是目前確定樣本中DNA(或cDNA)拷貝數最敏感、最準確的方法。實時熒光定量PCR法最大的優點是克服了終點PCR法進入平臺期或飽和期後定量的較大誤差，實現DNA/RNA的精確定量。該技術具有靈敏度和特異性高、能實現多重反應、自動化程度高、無汙染、實時和準確等特點，所以該技術從產生到現在短短的二十年時間，在科研及檢驗領域獲得了廣泛的應用，成為分子生物學領域不可或缺的一項重要技術。今天大閱哥就來跟您八一八實時熒光定量PCR的那些事……

實時熒光定量PCR(Real-time qPCR)是在PCR反應體系中加入一種熒光化學物質，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累積，熒光訊號強度也隨之等比例增加，每經過一個迴圈，收集一個熒光強度訊號，這樣我們就可以通過熒光強度變化實時監測整個PCR程序，使每一個迴圈變得“可見”，通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA(or cDNA)的起始濃度進行準確定量的方法。……什嗎？原理您都知道，好那咱們針對幾個重點問題來做回答吧！

 

 

Q1：實時熒光定量PCR主要應用在哪些方面？

A1：實時熒光定量PCR主要應用在以下3個方面：1.DNA或RNA的絕對定量分析。包括病原微生物或病毒含量的檢測，轉基因動植物的轉基因拷貝數檢測。2.基因表達差異分析。例如比較經過不同處理樣本之間特定基因的表達差異（如藥物處理，物理處理，化學處理等），特定基因在不同時期的表達差異以及基因晶片差異結果的驗證。3.定性分析。例如SNP檢測，基因分型，甲基化檢測等等。

 

Q2：實時熒光定量PCR主要用什麼方法？用什麼儀器？

A2：主要是Taqman探針法和SYBR Green I法：Taqman探針法特異性比較好，定量比較準確，可做多重PCR，但是探針設計難度高；SYBR Green I法使用方便，成本低，但是對引物的設計要求比較高，不能形成引物二聚體。

常見的儀器有ABI 7500、7900HT，羅氏LC480等，閱微基因採用ABI 7900HT，它是唯一的一款採用鐳射作為光源的熒光定量機器，靈敏度和準確性高，重複性好，且價格昂貴，是常規ABI 7500的2倍，常被用於高階實驗。

 

Q3：熒光定量PCR可以檢測哪些基因型別？

A3：可以檢測DNA，mRNA，miRNA，LncRNA和環狀RNA等。microRNA的實時定量PCR(Real-time quantitative PCR)檢測運用成熟的實時定量PCR技術準確、快速地定量檢測各種組織、原代細胞及細胞系中目的microRNA的表達情況，具有靈敏度高、實驗週期短和特異性高等特點。閱微基因的技術人員通過4年的探索和努力，在miRNA表達檢測方面積累了豐富經驗，探索出多種有效的實驗方法。

 

Q4：如何選擇合適的內參基因呢？

A4：常見的物種做mRNA試用actin做內參，miRNA檢測使用U6做內參，特殊物種根據文獻選擇合適的內參。對於一些無法確定內參的物種，我們可以提供內參基因篩選服務，選出穩定的內參用於後續實驗。

 

Q5：熒光定量PCR時需要對樣品做標準曲線嗎？

A5：常規驗證引物擴增效率需要針對每對引物做標準曲線，相對定量的標準曲線樣本採用濃度最高的模板作為標準品，絕對定量的標準品為包含待測基因的質粒DNA，標準品需稀釋5個不同的稀釋梯度，每個稀釋梯度10倍，相對定量標準品每個梯度稀釋2~5倍。如果引物擴增效率達不到2，用實際的擴增效率進行修正，但不影響變化趨勢，如果實驗要求不高，也可以不做。

 

Q6：我做的標準曲線，線性關係不好，原因何在？

A6：標準曲線線性關係不佳的原因可能有：1.加樣存在誤差使得標準品不呈梯度。2.標準品出現降解，應避免標準品反覆凍融，或重新制備並稀釋標準品。3.引物或探針不佳。

 

Q7：擴增曲線中為什麼會出現“無Ct值出現”的情況呢？

A7：可能是檢測熒光訊號的步驟錯誤：一般SG法採用72°C延伸時採集，Taqman法則一般在退火結束時或延伸結束採集訊號。也有可能是引物、探針或者模板降解。

 

Q8：我的Ct值是出來了，但是出現的太晚了（Ct>38）是腫麼回事？

A8：導致這種現象最可能的原因是擴增效率低，應該優化反應條件，設計更好的引物或探針；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。也有可能是PCR反應各成分不足，或者PCR產物太長，根據閱微基因的經驗，一般建議採用80-150bp的產物長度。

 

Q9：Ct值看著沒問題，可是為什麼熔解曲線不只一個峰呢？

A9：可能是引物設計不夠優化，先提高退火溫度，適當降低鎂離子濃度和引物的濃度，並注意上下游引物的濃度配比。優化後還是有非特異的峰，需要重新設計特異性引物擴增。

 

是不是覺得實時熒光定量PCR沒那麼簡單了呢～閱微基因從事熒光定量服務多年，有豐富的實驗經驗，通量高，且可以檢測低丰度的RNA樣本，比如血漿樣本、石蠟切片；另外，閱微基因還可以為您提供MicroRNA表達檢測，LncRNA、環狀RNA的驗證等，還等什麼，快call我們吧！