評估轉錄組從頭組裝準確度的新方法
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RNA-Seq技術，能夠進行大規模的轉錄組分析，從而徹底改變了基因組未測序物種的研究。為了研究這些轉錄組，首先我們要通過從頭轉錄組組裝確定一組轉錄本序列，利用RNA-Seq讀取資料重建轉錄本序列，無需基因組序列資訊的幫助。目前，一些可用的從頭轉錄組組裝軟體，許多是為Illumina平臺數據設計，而其他一些則針對Roche 454 Life Science平臺數據。這些組裝軟體，與它們相當大的使用者可調引數集相結合，可為一個單一資料集生成大空間的候選組裝件。然而，如何在這一空間中選出最準確的組裝——特別是當真實值（ground truth）是未知時，仍然是具有挑戰性的。
最近的許多研究已經致力於評估轉錄組的從頭組裝。在這些研究中使用的組裝評估方法可被分為兩大類：基於參考序列和無參考序列。基於參考序列的評估方法，使用先前已知的序列進行計算。例如，在組裝元件和參考轉錄本序列之間建立一種對應關係之後，我們就可以計算出與參考轉錄本精確匹配的一部分組裝元件，和組裝元件相匹配的一部分參考轉錄本，或者這兩者的組合（例如F1測度）。除了轉錄組，基因組和蛋白質序列也被用作組裝評估的參考序列。
然而，在大多數從頭組裝的情況下，參考序列是不可用的或不完整的，或者相當偏離目的樣本的真實性，這使得組裝評估任務更加的困難。在這種情況下，必須藉助於無參考序列評估測度。常用的無參考序列評估測度包括，中值重疊群長度、重疊群數量和N50。不幸的是，這些測度都很簡單，往往會產生誤導性。例如，N50，最流行的一種無參考序列評估測度，可以通過小元件而最大化。
這種測度的動機是，更好的組裝應該來自於較大的輸入讀取之間重疊數，因此將有更多的讀取被組裝為更長的重疊群。然而，我們很容易看出，通過將所有輸入讀長連線成一個單一重疊群而構建的一種小組裝，將取這種測度的最大值。總之，N50測量的是重疊群的連續性，而不是它們的準確性。其他過分簡單的無參考序列測度，對於組裝的精確度可能同樣有誤導性，但是有研究證明，當組裝包括“singletons”（即來自單個讀取的重疊群）時，一些測度可能提供一定的資訊。
最近在《Genome Biology》發表的一項研究中，來自加州大學伯克利分校、威斯康星大學、印第安大州立大學等處的研究人員，通過提出DETONATE（DE novo TranscriptOme rNa-seq Assembly with or without the Truth Evaluation）方法和軟體包，改進了最先進的轉錄組組裝評估測度。DETONATE由兩部分組成：RSEM-EVAL和REF-EVAL。RSEM-EVAL，DETONATE的主要元件，是一種基於新型概率模型的無參考序列評估方法，只依賴於一個元件和用來構建它的RNA-Seq讀長。
RSEM-EVAL與最近的方法相似，使用統計模型來評估或構建基因組和巨集基因組組裝，但是，正如本文將要討論的，由於轉錄本和可變剪接的不同丰度，它必然更加複雜。不同於簡單的無參考序列測度（如N50），RSEM-EVAL可結合多種因素。這個值可以用來選擇一個最佳的組裝軟體，優化一個組裝軟體的引數，引導新的組裝軟體設計為一個目標函式。此外，對於組裝中的每個重疊群，RSEM-EVAL提供一個值，可評估該重疊群如何由RNASeq資料支援，並可以用來過濾不必要的重疊群。
REF-EVAL——DETONATE的第二元件，是基於參考序列測度的一種工具。與現有參考序列為基礎的測度相比，它為組裝精確性提供了一種更為精細的檢視。
研究人員已經對真實和模擬資料進行了大量實驗，來證明RSEM-EVAL值的價值。首先，他們圍繞著一個單 一“真正”組裝，產生了一系列擾動元件，並且表明，RSEM-EVAL在最高得分的組裝中最接近於真實值。第二，他們對多個數據集超過200個組裝計算了RSEM-EVAL值和REF-EVAL基於參考序列測度，他們發現，RSEM-EVAL值一般與基於參考的測度有很好的相關性。這兩個最初實驗的結果表明，RSEM-EVAL評分可準確地評估從頭轉錄組組裝，儘管不知道真實值。第三，與幾種可供選擇的無參考和比較參考為基礎的測度相比，這項研究展示了RSEM-EVAL在準確性、適用性和執行要求方面的優勢。
最後，作為使用RSEM-EVAL值的一個演示，研究人員根據這一指南，組裝了再生蠑螈肢體的轉錄組。與先前研究中組裝方法所發現的基因相比，這次新進行的組裝，讓研究人員發現了參與蠑螈肢體再生過程的更多基因。
轉自生物通。