巨集基因組-擴增子分析流程：中文首發,史上最詳系,零基礎自學
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寫在前面
之前釋出的《擴增子圖表解讀》系列，相信關注過我的朋友大部分都看過了(連結直達7月文章目錄)。這些內容的最初是寫本實驗室的學生們學習的材料，加速大家對同行文章的解讀能力。
《擴增子分析解讀》系列文章介紹
擴增子分析是目前巨集基因組研究中最常用的技術，由於微生物組受環境影響大，實驗間重複較差，更需要更多的實驗重複和分析技術來保證結果的準確性、可重複性。
本系統文章叫分析解讀，即有詳細的擴增子分析流程程式碼，又有本人對使用引數、備選引數意義的解讀，可以讓大部分人零基礎學習並理解資料分析過程，並可親自實踐在自己的課題上，獲得更好、更合理的實驗結果。
本文采用目前最主流的擴增子測序資料型別HiSeq2500 PE250型別資料為例，結合目前主流方法QIIME+USearch優點組合定製的分析流程。本課程中所需的測序資料、實驗設計和課程分析生成的中間檔案，均可以直去百度雲下載。
連結：http://pan.baidu.com/s/1hs1PXcw 密碼：y33d。
學習前必讀
- 測序資料：百度雲原始連結的資料是隨時更新的，請儘量使用前下載連結裡的檔案。轉存入自己的帳號內檔案將不再更新，無法修正讀者指出的錯誤反饋。
- 本課程程式碼的執行，至少需要Linux平臺+安裝QIIME1.9.1，我之前釋出過QIIME1.9.1安裝的三種方法如下：
- 本套流程主要依賴QIIME1.9.1。之前釋出的QIIME2不是QIIME的升級版，而是完全獨立的分析系統，兩者沒有任何通用的地方，而且現在還不成熟，明年才有穩定版。請讀者千萬別混淆。不要再犯用QIIME2系統執行本教程擴增子分析流程解讀，無法找到相關程式的錯誤。
- 其它不在QIIME流程中的相關軟體，我在教程裡提供簡單的安裝方法，使用前仔細閱讀教程操作即可。
擴增子分析流程目錄
先看一下擴增子分析的整體流程，從下向上逐層分析。
擴增子分析流程，主要包手下面7部分，共21小節。
- 1質控,實驗設計,雙端序列合併
檢視原始資料的質量，編寫合格的實驗設計用於分析，雙端序列合併為單端的擴增子序列； - 2提取barcode,質控及樣品拆分,切除擴增引物
將Barcode序列從序列中拆除，篩選高質量的測序結果並標記文庫中每條序列中的樣品來源，最後切除擴增時使用的引物； - 3格式轉換,去冗餘,聚類
轉換QIIME生成fasta格式為Usearch要求格式；使用Usearch對序列去冗餘並篩選高丰度，極大降低下游計算量和去除噪音；最後使用用Usearch聚類生成OTU，預設會組內自動去除大量嵌合體； - 4去嵌合體,非細菌序列,生成代表性序列和OTU表
本講詳細講了嵌合體的概念，並使用參考資料庫去除嵌合體；學習基於引數資料庫篩選細菌序列，這些都是可選的操作，根據實際情況決定是否需要，最終生成高質量的OTU序列作為參考序列； - 5物種註釋,OTU表操作
這部分採於不同資料庫進行細菌或真菌註釋；同時根據實際情況，對OTU表進一步按樣品、丰度、物種等條件篩選； - 6進化樹,Alpha,Beta多樣性
將OTU多序列比對生成進化樹，為依賴進化關係的計算方法提供輸入檔案；再進行多種Alpha和Beta多樣性的計算； - 7物種分類統計,篩選進化樹和其它
對物種進行分類統計,篩選高丰度結果用於進化樹展示，和其它用於R統計分析的結果生成。
寫在後面
以上流程，是本人基於多篇高水平文章的解讀、類流程分析流程幫助的閱讀和自己理解的產物，不足之處，還請大家多留言討論或指正。
具體的分析步驟的使用，最重要的是相關專案經驗，其次是對課題科學問題的深入理解。自己能想清楚，自然知道如何分析更合理。
大家不要迷信流程一次可以分析出想要的結果，好的結果一般都是經過不斷思考，不斷優化和改進分析引數和方法得出的。發表前修改流程重新計算30次不算多。
這部分大家學會了，可以基於以上流程生成的文字資訊。採用R語言進一步統計分析，並繪圖各種出版級的圖片。我將會從下週起開始釋出，第一季擴增子繪圖有8種常用圖型的繪圖，及相關的統計方法，與擴增子圖表解讀的順序相對應哦！
希望本課程對大家有幫助！！！
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