我們用來練手的文章發表在 Nature Communication ，”High contiguity Arabidopsis thaliana genome assembly with a single nanopore flow cell”, 非常不要臉的說，這篇文章是我師爺實驗室發的。

簡單講講故事內容，就是他們實驗室買了一臺nanopore儀器，就是下面這臺， 目前儀器價格國內是8K左右，當然測序的價格就另說了。如同買臺PS4主機，還要買遊戲，買個單反，你還得買鏡頭。儀器只是敗家的開始！

他們認為三代測序目前有兩大問題，測的還不夠長以及不夠準。nanopore解決了其中一個問題，不夠長。Arabidopsis thaliana

光測序不行，還得組裝對吧。傳統的組裝方法是想辦法利用高深度和隨機錯誤進行糾錯，然後用糾錯後的長序列進行組裝，最後用二代進行糾錯。對於一臺不錯的伺服器（20W起步吧）大約花個十天半個月就行。作者或許認為買一臺20多w的外設配合不到1w的測序儀可能是太蠢了，於是他用了比較Li Heng大神開發的工具，Minimap+miniasm進行組裝，然後用racon+pillon進行糾錯，用了一臺Macbook Pro 15.6寸花了4天就搞定了，並且和常規工具比較，還算過得去哦。

下面就是正式的分析：

根據文章提供的專案編號”PRJEB21270”, 在European Nucleotide Archive上找到下載地址。

進入這個頁面之後，就可以去下載作者用到的所有資料，我們下載Sequel和MinIon和Illuminia的資料就好了，資料量加起來差不多30G。

## Sequal
wget -c -q ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/ERA111/ERA1116568/bam/pb.bam
wget -c -q ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/ERA111/ERA1116568/bam/pb.bam.bai
## MinION
 

wget -c -q ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/ERA111/ERA1116595/fastq/ont.fq.gz
# Illuminia MiSeq
wget -c -q ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/ERA111/ERA1116569/fastq/il_1.fq.gz
wget -c -q ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/ERA111/ERA1116569/fastq/il_2.fq.gz

這就是大神的自信，把程式碼都給你，反正你也看不懂。當然我在重複的時候用的都是最新的軟體，所以會有所不同

第一步：拿著80%～90%正確率的原始資料相互比對， 找序列之間的Overlap。這一步，我花了30分鐘

time ~/opt/biosoft/minimap2/minimap2 -t 10 -x ava-ont ont.fq ont.fq > gzip -1 ont.paf.gz &

第二步：找到Overlap，就能夠進行組裝了。這一步我花了2分鐘

time ~/opt/biosoft/miniasm/miniasm -f ont.fq ont.paf > ONTmin.gfa &
awk '/^S/{print ">"$2"\n"$3}' ONTmin.gfa | seqkit seq > ONTmin_IT0.fasta &

第三步： 原始的組裝結果充滿了錯誤，所以需要進行糾錯。糾錯分為兩種，一種是用三代自身資料，一種是用二代資料進行糾錯。當然這兩步都是需要的

首先使用三代資料進行糾錯，古語有云“事不過三”一般迭代個三次就差不多。這三步，差不多用了1個小時。

# Iteration 1
~/opt/biosoft/minimap2/minimap2 ONTmin_IT0.fasta ont.fq > ONTmin_IT0.paf &
time ~/opt/biosoft/racon/build/bin/racon -t 10 ont.fq ONTmin_IT0.paf ONTmin_IT0.fasta > ONTmin_IT1.fasta &
# Iteration 2
~/opt/biosoft/minimap2/minimap2 ONTmin_IT1.fasta ont.fq > ONTmin_IT1.paf
time ~/opt/biosoft/racon/build/bin/racon -t 10 ont.fq ONTmin_IT1.paf ONTmin_IT1.fasta> ONTmin_IT2.fasta
# Iteration 3
~/opt/biosoft/minimap2/minimap2 ONTmin_IT2.fasta ont.fq > ONTmin_IT2.paf
time ~/opt/biosoft/racon/build/bin/racon -t 10 ont.fq ONTmin_IT2.paf ONTmin_IT2.fasta > ONTmin_IT3.fasta

之後使用二代資料進行糾錯。二代資料雖然短，但是測序質量高，所以一般都要用它進行糾錯。推薦用30X PCR free的illuminia 測序資料。

Step 1: 資料預處理，過濾低質量短讀，去接頭。工具很多，常用的是trimmomatic，cutadapter. 我安利一個國內海普洛斯搞的一個工具fastp。

# data clean
fastp -q 30 -5 -l 100 -i il_1.fq.gz -I il_2.fq.gz -o i1_clean_1.fq -O i1_clean_2.fq 

這裡標準為：平均質量高於Q30，對5‘端進行低質量鹼基刪除，保留大於100bp的短讀

Step2: 比對，這一步基本都只用了bwa了

# align
bwa index ONTmin_IT3.fasta
bwa mem -t 8 ONTmin_IT3.fasta il_clean_1.fastq il_clean_2.fastq | samtools sort [email protected] 8 > ONTmin_IT3.bam

step3: 使用比對後的BAM檔案進行糾錯

# short read consensus call
java -Xmx16G -jar pilon-1.22.jar --genome ONTmin_IT3.fasta --frags ONTmin_IT3.bam --fix snps --output ONTmin_IT4

二代糾錯的時間明顯比之前的久，需要一天時間。

大家拿出自己的筆記本實際感受下唄

參考文獻

• nanopore組裝擬南芥: High contiguity Arabidopsis thaliana genome assembly with a single nanopore flow cell
• 不糾錯組裝: Minimap and miniasm: fast mapping and de novo assembly for noisy long sequences
• 三代組裝軟體評測: Comprehensive evaluation of non-hybrid genome assembly tools for third-generation PacBio long-read sequence data