基因編輯簡史
【編者按】基因編輯技術的核心是一個分子工具——2012年發現的CRISPER-Cas9。基因技術的飛速發展，也帶來了很多道德社會問題，基因工程是否應該被用於人類疾病的治理或者改變人的外貌智力等性狀之類的問題，近幾年來一直在被討論。
本文首發於美柏醫健，作者Fernweh；經億歐大健康編輯，供行業人士參考。
基因編輯（Gene editing）是指特異性改變基因序列，利用酶，特別是核酸酶來對DNA鏈（DNA strand）進行剪下，移除已有的DNA，或者插入代替的DNA。基因編輯是近幾年的大熱話題，本文就將回顧一下基因編輯的發展歷史。
大事年表
1973年：第一個基因工程生物--新增一個基因後可以抵抗抗生素的細菌。
1974年：美國國家科學院（The National Academy of Sciences）暫停基因工程實驗直到可以檢查安全問題。
1975年：生物學家建立風險評估原則，儘量減低（mitigation）風險，強調公眾參與和透明度。
1982年：FDA通過第一個基因工程人類藥合成胰島素（synthetic insulin）。
1994年：Calgene推出第一個基因工程食物Flavr Savr番茄，它在成熟時可以不掉下來（stay firm when ripe）。
1996年：孟山都公司（Monsanto）推出第一批基因修飾農作物,很快這些基因修飾食品佔據市場。
2003年：遺傳學家Austin Burt第一個提出“自私基因” （selfish gene）--一個保證大多數後代遺傳的基因，可以用作對另一個物種的生物防治。但這個想法在當時還是理論性的。
2012年：University of California–Berkeley和 Broad Institute 的研究人員發現，一種細菌免疫系統CRISPR可以作為基因編輯工具，在生物體的基因組中的任何地方對DNA進行特定的改變。
2014年：Kevin Esvelt等人發表一篇論文，展示如何利用CRISPR進行遺傳修飾，永久改變或根除它們。
2015年：第一隻基因驅動實驗室果蠅，第一隻基因驅動蚊子。
2016年：基因驅動在農業、疾病減少和保護方面具有巨大潛力，但在此類生物體釋放到環境中之前，建議進行更多研究。超過150個團體呼籲暫停基因驅動研究，但暫停期在聯合國生物多樣性公約（ United Nations Convention on Biological Diversity）中被取消。
2017年：第一隻基因驅動哺乳動物。FDA通過針對癌症的基因改變治療。
基因編輯技術的核心是一個分子工具——2012年發現的CRISPER-Cas9。基因技術的飛速發展，也帶來了很多道德社會問題，基因工程是否應該被用於人類疾病的治理或者改變人的外貌智力等性狀之類的問題，近幾年來一直在被討論。
修正基因錯誤的早期嘗試
利用基因編輯來治療疾病或改變性狀這個想法，可以追溯到20世紀50年代DNA雙螺旋的發現。20世界中期，研究者發現，DNA的鹼基序列可以從父母傳給子代，一些微小的序列就會對健康產生影響。
認識到這點後，人們就猜測識別導致遺傳性疾病的“分子錯誤”可以成為解決這些錯誤的手段，從而能夠預防或逆轉疾病。這一概念是基因理論的基本理念。
但基因技術的發展充滿了困難。早期並不是集中在修正基因錯誤，而是嘗試把突變基因功能性拷貝帶來的結果最小化，插入基因組或者維持作為染色體外單元。儘管這個方法在一些情況下是有效的，但是很複雜而且有侷限性。
為了完全修正基因錯誤，研究者需要使一個DNA雙鏈在目標位置斷裂，一旦斷裂後，缺口處能夠被細胞通過模板（template）高效地修復，直接將“壞”的序列用“好”的序列代替。但是準確地在目標位置製造斷裂，而不涉及其他地方這一點並不容易。
在目標位置斷開DNA鏈
在發現CRISPER-Cas9提出之前，我們有兩種使雙鏈位置特異性斷裂的方法，一種是利用鋅指核酸酶（ZFNs），另一種是利用類轉錄啟用因子效應物核酸酶（TALENs）。
ZFNs是一種人工改造的核酸內切酶，由一個一系列 Cys2-His2鋅指蛋白串聯組成的DNA 識別域和一個由FokI羧基端96個氨基酸殘基組成的非特異性核酸內切酶構成。ZFN 要切割靶位點必須以二聚體綁到靶位點上。因此兩個ZFN分別用鋅指結構識別5′到3′方向和3′到5′方向的DNA鏈，當兩個ZFN分別結合到位於DNA的兩條鏈上間隔5至7個鹼基的靶序列後，可形成二聚體，進而啟用FokI核酸內切酶的剪下結構域，使DNA在特定位點產生雙鏈斷裂。
雖然ZFN的出現大大促進了基因組靶向修飾技術, 但是, 由於鋅指基序(motif)同其靶序列的對應性並不特異，對於每一個特定的靶點，往往需要構建龐大的鋅指表達文庫，通過實驗篩選出高效且特異結合靶序列的鋅指蛋白；而且在基因組上找到合適的ZFN靶點也比較困難。而TALE在識別靶點的特異性方面和設計方面都比ZFN更有優勢。TALENs是由特異性DNA結合結構域 TALE和DNA切割結構域Fok I核酸內切酶組成。TALE蛋白家族來自植物病原體——黃單胞桿菌(Xanthomonas spp.)。TALE與DNA序列特異性結合後，二聚體Fok1核酸酶定點剪下，導致DNA雙鏈斷裂。
CRISPR-Cas9 技術利用RNA-DNA結合，而非蛋白質-DNA結合來指導核酸酶活性，簡化了設計，使應用範圍更廣泛。CRISPR是clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats的縮寫，意為成簇的規律間隔的短迴文重複序列，廣泛存在於細菌和古細菌的基因組中，是一種細菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫機制。
當細菌檢測到病毒DNA，它會產生出兩種較短的RNA， 其中一段RNA包含與入侵病毒相對應的片段。這兩種RNA與蛋白質組合成一個複合體，即Cas9。Cas9蛋白其與FokI酶功能相似，但不需要形成二聚體才能發揮作用，可以分別切割DNA兩條單鏈。當相符的片段，即所謂的嚮導RNA（guide RNA）在病毒體內找到他的目標時，Cas9就會剪下下目標DNA，消滅病毒。
研究者發現，它不僅可以消滅病毒DNA，只要改變一下向導RNA，與想要的目標符合就行。而DNA-RNA特異性結合只需瞭解 Watson-Crick鹼基配對原則，因此CRISPR-Cas9系統優於使用ZFNs或者TALENs的融合蛋白設計。2015年，張鋒及其同事發現了一種更具潛力的CRISPR系統，即CRISPR-Cpf1系統。DNA切割酶Cas9與兩條小RNAs形成了一種複合物，兩條RNAs均是獲得切割活性的必要條件。
Cpf1系統更簡單一些，它只需要一條RNA。Cpf1酶也比標準SpCas9要小，使得它更易於傳送至細胞和組織內。Cpf1以一種不同於Cas9的方式切割DNA。當Cas9複合物切割DNA時，它切割的是同一位點的兩條鏈，留下的“平端”（blunt ends）在重新連線時往往會發生突變。
採用Cpf1複合物生成的兩條鏈切口是偏移的，在裸露端留下了短懸端（overhang）。這將有助於精確插入，使得研究人員能夠更有效及精確地整合一段DNA。CRISPR算是當今生命科學領域最火熱的基因編輯技術，接下來我們簡單介紹CRISPR的歷史以及推動這一領域向前發展的科學家們。
1993-2005, Francisco Mojica：發現CRISPR及其功能
Francisco Mojica是1993年報道的第一個描述現在被稱為CRISPR基因座的研究人員。他在整個20世紀90年代都在研究它們，並且在2000年，他認識到被報道的不同重複序列實際上共享了一組共同的特徵，現在我們知道這是CRISPR序列的標誌（他與Ruud Jansen共同創造了該名詞 CRISPR，Jansen在2002年首次使用該術語）。
2005年，他報告說這些序列與噬菌體基因組的片段相匹配，基於這一發現他提出CRISPR是一種適應性免疫系統的假說，後來被證明這個假說是正確的。另一個小組在同一時間發表了類似的研究結果。
2005.03, Alexander Bolotin：發現Cas9和PAM
Alexander Bolotin在研究剛剛測序的嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）時，發現了一個不尋常的CRISPR基因座。儘管CRISPR陣列與先前報道的系統相似，但它缺少一些已知的cas基因，而是包含新的cas基因，包括編碼大分子蛋白質的基因，他們預測該蛋白具有核酸酶活性，就是現在的Cas9。
此外，他們指出，與病毒基因具有同源性的間隔區在一端都具有共同的序列。該序列是原型間隔物相鄰基序（PAM），是目標識別所必需的。
2006.03, Eugene Koonin：適應性免疫的假設方案
Koonin通過計算分析研究了直系同源蛋白質簇，基於天然間隔區陣列中與噬菌體DNA同源的插入物，提出了細菌免疫系統CRISPR級聯的假設方案，放棄了先前Cas蛋白可能包含新的DNA修復系統的假設。
2007.03, Philippe Horvath：適應性免疫的實驗證明
Horvath及其同事通過實驗證明，CRISPR系統確實是一種適應性免疫系統：它們將新的噬菌體DNA整合到CRISPR陣列中，這使它們能夠對抗下一波噬菌體的攻擊。此外，他們表明Cas9可能是干擾所需的唯一蛋白質，但CRISPR系統滅活入侵噬菌體的過程的細節尚不清楚。
2008.03, John van der Oost：間隔序列被轉錄成指導RNA
科學家們很快開始研究CRISPR-Cas9系統具體是怎樣干擾入侵的噬菌體的。John van der Oost及其同事發現在大腸桿菌（Escherichia coli）中，來自噬菌體的間隔序列被轉錄成小RNA，稱為CRISPR RNA（crRNA），引導Cas蛋白到達目標DNA。
2008.10, Luciano Marraffini and Erik Sontheimer：發現CRISPR作用於目標DNA
Luciano Marraffini and Erik Sontheimer發現CRISPR系統的靶向分子是DNA，而不是RNA。這有點令人驚訝，因為許多人認為CRISPR與真核RNAi沉默機制平行，後者靶向RNA。
Marraffini和Sontheimer在他們的論文中明確指出，如果將該系統轉移到非細菌系統，該系統可能是一個強大的工具。（然而，應該注意，不同型別的CRISPR系統可以靶向RNA。）
2010.12 Sylvain Moineau：發現Cas9剪下目標DNA
Moineau及其同事證明，CRISPR-Cas9在PAM上游3個核苷酸的位置，對靶DNA產生精確的雙鏈斷裂。他們還證實Cas9是CRISPR-Cas9系統中切割所需的唯一蛋白質。這是II型CRISPR系統的一個顯著特徵，由單個大蛋白（此處為Cas9）與crRNAs共同介導干擾。
2011.03 Emmanuelle Charpentier：發現cas9系統中的tracrRNA
Emmanuelle Charpentier團隊對釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）進行了小RNA測序，其具有含Cas9的CRISPR-Cas系統。他們發現，除crRNA外，還存在第二種小RNA，稱為反式啟用CRISPR RNA（tracrRNA）。他們發現tracrRNA與crRNA形成雙鏈體，正是這種雙鏈體將Cas9引導至其靶標。
2011.07, Virginijus Siksnys：CRISPR系統可以在其他物種中異源地起作用
Siksnys及其同事克隆了來自嗜熱鏈球菌（一種II型系統）的整個CRISPR-Cas基因座，並在大腸桿菌（不含II型系統）中表達，發現它能夠提供質粒抗性。這表明CRISPR系統是獨立的單元並且證實了II型系統的所有必需元件都已知了。
2012.09, Virginijus Siksnys：Cas9介導的切割的生化表徵
利用其異源系統，Siksnys和他的團隊將來自大腸桿菌菌株的crRNA複合物Cas9純化，該菌株經過工程改造以攜帶嗜熱鏈球菌CRISPR基因座並進行一系列生化實驗表徵Cas9的作用模式。
他們驗證了切割位點和PAM的需求，並使用點突變，他們發現RuvC結構域切割非互補鏈，而HNH結構域切割互補位點。他們還指出，crRNA可以減少到20-nt的伸展，足以有效切割。他們表明可以通過改變crRNA的序列來重新程式設計Cas9以定位他們選擇的位點。
2012.06, Charpentier and Jennifer Doudna與Gasiunas等人的研究結果相似。幾乎同時由Emmanuelle Charpentier與加州大學伯克利分校的Jennifer Doudna合作報道。 Charpentier和Doudna還報告說，crRNA和tracrRNA可以融合在一起，形成一個單一的合成導向RNA，進一步簡化了系統。
2013.01, Feng Zhang：利用CRISPR Cas9進行基因編輯
之前曾參與其他基因組編輯系統如TALENs的Zhang首先成功地將CRISPR-Cas9用於真核細胞的基因組編輯。Zhang和他的團隊設計了兩種不同的Cas9直向同源物（來自嗜熱鏈球菌和化膿性鏈球菌）並證明了人和小鼠細胞中的靶向基因組切割。
他們還表明系統（i）可以程式設計為靶向多個基因組位點，（ii）可以驅動同源定向修復。來自哈佛大學George Church實驗室的研究人員在同一期“Science”雜誌上報告了類似的研究結果。
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