基因治療：醫學革命正在到來
【編者按】基因編輯的應用場景更廣、潛力也更大，是未來基因治療的發展方向，而此前受到第一代基因編輯技術——ZFN專利壟斷的限制，整個基因編輯行業的發展停滯了多年，隨著新一代基因編輯技術（TALEN和CRISPR）的出現，行業的發展速度有望得到大幅提升，從而使基因治療再上一個臺階。
本文發於生物製品圈，作者DC；經億歐大健康編輯，供行業人士參考。
一、 基因手術刀，治療新選擇，基因手術刀
（一）基因治療：於遺傳操控的疾病方案
基因治療是指用正常的基因匯入人體細胞，以糾正或補充因基因缺陷和異常所引起的疾病，是一種根本性的治療策略。匯入的基因可以是與缺陷基因對應、在體內表達具有特異功能的同源基因，也可以是與缺陷基因無關的治療基因。
在生物體內，遺傳資訊沿著“DNA-RNA-蛋白質”的方向逐級傳遞（中心法則），蛋白質是遺傳資訊的表現形式，因此疾病發生時多表現為蛋白質層面的異常。目前絕大多數的藥物均以蛋白質為靶點，如治療腫瘤的小分子靶向藥物和大分子單抗藥物，通過改變蛋白質的功能來治療疾病。
基因治療則是從蛋白質的上游——DNA入手，通過調控DNA來改變遺傳資訊傳遞，進而改變蛋白質的性狀，實現從源頭上治療疾病。此外，也有少部分藥物，如小核酸藥物Patisiran，以RNA為靶點對疾病進行治療，從廣義上來說這類藥物也屬於基因治療的範疇，本文不涉及這類藥物。
根據中心法則，每一個生理過程都可以理解為特定的基因在特定的時間和空間裡發生特定強度表達的結果，如果這種平衡被打破就會誘發疾病。從這個角度看，幾乎所有疾病的發生都可以在DNA水平進行解釋，這也是基因治療的理論基礎。
根據基因變異型別的不同，導致疾病發生的基因異常大致可分為兩類：（1）基因突變導致基因指導合成的蛋白質功能異常，表現為蛋白質沒有功能、功能變弱或功能過強，甚至產生有害蛋白；
（2）基因表達強度異常，表現為不該表達的基因表達、應該表達的基因不表達、基因表達的強度過高或過低等。因此，從理論上來說基因治療幾乎可治癒絕大多數的疾病。然而，疾病的發生往往涉及多個基因，對應的蛋白質之間的相互作用形成了一個龐大的調控網路，僅對某一個或幾個基因進行調節難以達到治療疾病的目的。
此外，科學家對人體基因功能和疾病發生機制的研究仍然非常有限，存在大量未被發現的新基因和訊號網路。基因和疾病太多的不確定性極大地限制了基因治療的應用領域，故而基因治療目前只適用於少數致病機制或治療方案非常明確的疾病，如單基因遺傳病、腫瘤等。
與常規的藥物/治療方案相比，基因治療能從源頭上解決疾病的發生，故而在一些目前無法治療或療效不佳的疾病上有明顯優勢，如血友病等。在安全性上，基因治療仍屬於新興技術，人們對基因和疾病的認知還有很多盲區，且基因更改後通常難以逆轉，潛在風險較大；而傳統的藥物治療大多已經經歷了幾十年甚至上百年的發展和使用，風險相對可控，因此我們認為未來常規藥物仍然是疾病治療的首選方案，基因治療更多地是作為常規治療方案的補充，為那些常規治療方案無效或療效不佳的疾病的患者提供新的選擇。
（二）基因治療的操作流程
根據給藥方式的不同，基因治療可分為“體內”治療和“離體”治療兩大類。
“體內”基因治療的操作流程相對簡單，大致可分為3個步驟：（1）利用基因工程的方法將正常基因插入到病毒載體的DNA上；（2）將重組後的病毒DNA體外包裝產生具有感染能力的完整工程病毒；（3）把重組後的病毒直接注入病人體內，病毒感染病變細胞並將正常基因帶到靶細胞中，實現疾病的治療。
“離體”基因治療可分為6個步驟：（1）將正常基因插入到病毒載體的DNA上；（2）將重組後的病毒DNA體外包裝產生具有感染能力的完整工程病毒；（3）獲取病人的體細胞，如造血幹細胞等，體外培養擴增；（4）用重組後的病毒感染獲取的病人細胞，病毒把正常基因匯入靶細胞中；（5）對攜帶正常基因的重組細胞體外培養擴增；（6）將攜帶正常基因的重組細胞回輸到病人體內，實現疾病的治療。
（三）歷經波折，基因治療終見曙光
以標誌性歷史事件為分界線，基因治療的發展大致可分為初期探索、狂熱發展、曲折前行、再度繁榮4個階段。
初期探索：1963年，美國分子生物學家、諾貝爾生理學或醫學獎獲得者Joshua Lederberg第一次提出了基因交換和基因優化的理念，為基因治療的發展奠定了基礎；1970年，美國醫生Stanfield Rogers試圖通過注射含有精氨酸酶的乳頭瘤病毒來治療一對姐妹的精氨酸血癥，這是首例人體試驗，試驗以失敗告終。此後幾十年間科學家又陸續開展了多項臨床試驗，但這個時期治療技術還不成熟，因此基因治療的發展也始終不慍不火。
狂熱發展：1990年，被後人稱為“基因治療之父”的William French Anderson醫生領銜開展了針對重症聯合免疫缺陷病的基因治療，患者為一名美國4歲女孩。接受治療後，其機體產生腺苷脫氨酶的能力有所提高，病情得到緩解，該患者目前仍然存活。兩年後又有一例基因治療臨床試驗取得成功。自此，患者、醫生和科學家的熱情迅速被點燃，行業進入狂熱發展的階段，10年間開展了上千例臨床試驗。總體而言，這個時期的基因治療取得了初步的成功，但技術上仍存在很大的安全風險，行業進入了短暫的非理性發展階段。
曲折前行：1999年，美國男孩Jesse Gelsinger參與了賓夕法尼亞大學的基因治療專案，接受治療4天后因病毒引起的強烈免疫反應導致多器官衰竭而死亡。該事件是基因治療發展的轉折點。此外，FDA曾於2003年暫時中止了所有用逆轉錄病毒來改造血液幹細胞基因的臨床試驗，但經過3個月嚴格稽核權衡後，又允許基因治療臨床試驗繼續進行。這個時期的基因治療相比20世紀90年在技術上有所發展，但仍存在較大的安全隱患，行業整體上理性發展。
再度繁榮：2012年，荷蘭UniQure公司的Glybera在歐盟審批上市，用於治療脂蛋白脂肪酶缺乏引起的嚴重肌肉疾病。同年，Jennifer Doudna以及美籍華人科學家張峰發明了CRISPR/CAS9基因編輯技術，這是基因治療領域革命性的事件。自此，基因治療技術上的一些瓶頸得到突破，有效性和安全性都有所提高，行業迎來新一輪的發展高潮。
二、技術發展：“轉基因”和“基因編輯”齊頭並進
（一）轉基因：缺啥補啥
基因治療誕生之初主要用於正常基因功能缺失遺傳病的治療，如聯合免疫缺陷病（患者20號染色體上編碼腺苷脫氨酶的基因出現遺傳突變失去原有的功能），因此對於這類疾病最直接有效的治療思路就是“缺啥補啥”，利用載體將正常基因匯入患者細胞內即可實現治療的目的。目前最常用的載體是人工改造後的工程病毒。
1、病毒載體：大自然賜予基因治療的禮物
天然的病毒對人體細胞有很強的感染性，能把病毒自身的基因組匯入到人體細胞中，但同時也具有較強的致病性。以逆轉錄病毒感染細胞為例，病毒先與細胞表面的受體結合，通過內吞進入細胞中，然後病毒攜帶的逆轉錄酶會將病毒RNA逆轉錄成為DNA並插入宿主基因組中，這使得病毒的遺傳資訊可以永久性地存在於宿主細胞中並隨細胞的複製增殖傳遞給子代細胞。基於逆轉錄病毒的這個特性，科學家對病毒進行改造，在保留病毒強感染能力的前提下，創造出了複製缺陷、低毒性的工程病毒，提高病毒使用的安全性，再把正常的人體基因新增到病毒基因組中，正常基因最終隨著病毒基因一起永久地整合到人體細胞的基因組上，從而達到基因補償的效果，恢復病變細胞的正常功能。
目前臨床上基因治療使用較多的病毒載體主要是逆轉錄病毒（Retrovirus）、慢病毒（Lentivirus）和腺相關病毒（AAV）。
（1）逆轉錄病毒：強大的基因載體，然插入突變成其軟肋
逆轉錄病毒呈球形，直徑約為100nm，由兩條相同的單鏈RNA、逆轉錄酶以及包裹其外的核衣殼和包膜組成。
根據病毒種類的不同，目前常用的逆轉錄病毒可分為兩代。
第一代逆轉錄病毒以γ-retrovirus和C-type retrovirus為代表，是臨床上最早使用的逆轉錄病毒型別。通常所說的逆轉錄病毒指的就是第一代逆轉錄病毒。與病毒載體出現之前的常規轉基因方法相比，逆轉錄病毒的優勢主要表現為感染效率高、感染細胞譜系廣、基因穩定表達等。
感染效率高：病毒-細胞感染模式是由數億年的生物進化和自然選擇發展而來的，逆轉錄病毒對細胞的感染能力要普遍強於人工的轉基因方法，大幅提升了轉基因的成功率。
感染細胞譜系廣：逆轉錄病毒對多種動物細胞都表現出較強的感染能力，而此前的轉基因方法只對部分特定型別的細胞有效。
基因穩定表達：逆轉錄病毒能把目的基因整合到宿主細胞的基因組中，使目的基因穩定存在並長期表達，隨著宿主細胞的分裂增殖而傳遞給子代細胞。
然而，逆轉錄病毒載體是一把“雙刃劍”，其病毒本身的特性也帶來了諸如病毒毒性、免疫原性、基因插入突變等許多問題。
病毒毒性和免疫原性：儘管科學家已經對逆轉錄病毒進行了一系列的改造，儘可能地降低其對細胞的毒性，但只要病毒仍具有感染細胞、整合基因組的能力，即會對宿主細胞的正常生理功能產生不同程度的影響，存在一定的潛在風險。同時，改造後的工程病毒仍屬於病毒的範疇，故而存在免疫原性，容易誘發人體的免疫反應，過度的免疫反應對人體會造成不可逆的損傷甚至死亡。
基因插入突變：逆轉錄病毒一個很重要的功能就是能把自身的遺傳物質插入到宿主細胞的基因組中，科學家也是利用這個特性進行基因治療。然而逆轉錄病毒基因組會整合到宿主基因的5’非編碼區，這個區域通常對基因的表達調控起到很關鍵的作用，故而逆轉錄病毒基因插入容易干擾宿主細胞正常的基因表達，甚至啟用原癌基因，使細胞發生癌變。
只能感染分裂的細胞：逆轉錄病毒只能感染分裂的細胞，對那些沒有分裂能力的終末分化細胞，如神經細胞等基因異常導致的疾病無能為力。
感染細胞不具靶向性：逆轉錄病毒對感染的細胞沒有選擇性，這在一定程度上限制了逆轉錄病毒在臨床上的應用範圍，不利於那些需要把目的基因匯入特定細胞類群的“體內”基因治療方案。
病毒毒性和免疫原性：儘管科學家已經對逆轉錄病毒進行了一系列的改造，儘可能地降低其對細胞的毒性，但只要病毒仍具有感染細胞、整合基因組的能力，即會對宿主細胞的正常生理功能產生不同程度的影響，存在一定的潛在風險。同時，改造後的工程病毒仍屬於病毒的範疇，故而存在免疫原性，容易誘發人體的免疫反應，過度的免疫反應對人體會造成不可逆的損傷甚至死亡。
目的基因的表達量與正常狀態存在差異：目的基因是裝載到逆轉錄病毒基因組上而匯入患者細胞的，受到裝載容量的限制，通常無法把人體基因對應的表達調控元件一起打包到病毒載體裡，因此控制目的基因表達強度的調控元件來自病毒本身，故而通過這種方式補償的基因的表達水平往往與正常生理狀態下有所不同，使治療效果打折扣。
針對第一代逆轉錄病毒的侷限性，科學家又做了改進，發明了第二代逆轉錄病毒，主要代表是慢病毒（Lentivirus）、泡沫病毒（Spumavirus）等。以慢病毒為例，第二代逆轉錄病毒主要在感染細胞型別、裝載容量、基因組插入方式等方面進行了優化。
對分裂細胞和非分裂細胞均可感染：慢病毒突破了“只能感染分裂細胞”的限制，有助於臨床應用範圍的擴大。
可攜帶的目的基因片段更大：病毒載體對目的基因的裝載容量是有限的，若目的基因片段過大則無法用病毒作為載體匯入到患者細胞中，因此在其他條件都不變的前提下，病毒的裝載容量越大越好。相對於第一代逆轉錄病毒，慢病毒在裝載容量上有所提升。
誘發癌變的風險降低：慢病毒的基因組通常整合到宿主細胞基因組的編碼區，而且是隨機插入、專一性不強，因此大大降低了慢病毒基因組集中插入到一個癌症相關基因的附近、啟用原癌基因的可能性，從而降低了誘發細胞癌變的風險。自2009年第一個基於慢病毒的基因治療開展以來，截至2015年已經有超過300個臨床試驗使用了慢病毒載體，但所有接受治療的患者無一產生癌症。
慢病毒屬於逆轉錄病毒大類，故而逆轉錄病毒載體共同的弊端仍然存在，如病毒毒性、免疫原性、基因整合引起的宿主基因突變、目的基因的表達量與正常狀態不同、細胞感染不具靶向性等。
（2）腺相關病毒：非整合型病毒載體大有作為
腺相關病毒是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒，其基因組DNA小於5Kb，無包膜，外形為裸露的20面體顆粒。腺相關病毒不能獨立複製，只有在輔助病毒，如腺病毒、單純皰疹病毒等存在時才能進行復制、感染並裂解宿主細胞，否則只能建立溶源性潛伏感染（感染宿主細胞並潛伏，但不會裂解宿主細胞）。
與第一代、第二代逆轉錄病毒相比，腺相關病毒的優勢主要表現在基因組非整合性和組織靶向性兩個方面。
基因組非整合性：腺相關病毒與慢病毒相似，均可感染分裂和非分裂的細胞，但攜帶目的基因的腺相關病毒基因組進入宿主細胞後並不會插入宿主細胞的基因組中，而是以遊離DNA的形式穩定存在於宿主細胞中（部分型別的野生型腺相關病毒基因組會插入宿主基因組），並長時間地合成正常的蛋白質，實現疾病的治療。由於“基因組非整合”的特性，腺相關病毒載體不會引起宿主細胞基因組的插入突變，從而提高基因治療的安全性。
組織靶向性：目前科學家已經發現了十幾種腺相關病毒亞型，不同亞型的病毒對不同組織細胞有不同的親和性，從而部分解決了病毒載體組織細胞靶向性的問題。例如，最常用的血清2型腺相關病毒（AAV2）對骨骼肌細胞、神經元、細胞平滑肌細胞和肝細胞具有高親和性。
除了病毒載體病毒毒性、免疫原性、目的基因的表達量與正常狀態不同的通病以外，腺相關病毒還存在可攜帶的目的基因片段較小、目的基因易被稀釋等問題。
可攜帶的目的基因片段較小：逆轉錄病毒攜帶目的基因的容量通常在8Kb左右，而腺相關病毒僅為4.5Kb。
目的基因易被稀釋：腺相關病毒基因組以遊離DNA的形式存在於宿主細胞，並不插入宿主基因組中，因此在宿主細胞發生分裂增殖時，病毒載體匯入的“補償基因”並不會隨著宿主DNA的複製而複製。當宿主細胞分裂成兩個子細胞後，目的基因的數量也會被稀釋，最終逐漸丟失，故而腺相關病毒在感染長期存活的非分裂細胞或分裂次數較少的細胞時優勢較為明顯。
2、非病毒載體：轉基因的另一條出路
病毒載體無論如何改進，終究會存在病毒毒性、免疫原性等潛在風險，因此近年來科學家嘗試利用非病毒載體的方式將目的基因運送至患者細胞中，大致可分為物理方法和化學方法兩大類，其中物理方法的代表是顯微注射、基因槍、電轉導等，化學方法的代表是脂質體法、奈米顆粒等。
與病毒載體相比，非病毒載體具有低細胞毒性、弱免疫原性的優勢；同時，非病毒載體的生產流程比病毒載體更標準化，因此大規模量產要容易得多。然而，非病毒載體比較大的弊端還是低轉染效率，即利用非病毒載體把目的基因匯入細胞要做到和病毒載體一樣高效仍比較困難，以及適用的細胞型別有限，不像病毒載體那樣的廣譜性。目前非病毒載體技術還在不斷優化中，待技術進一步成熟以後，其應用範圍也有望得到擴大。
（二）基因編輯：破除“缺啥補啥”的困境，極大拓寬基因治療應用範圍
利用病毒載體，科學家已經可以實現部分疾病的基因治療並取得了一些成效。從原理上來看，轉基因的治療策略是“缺啥補啥”，因此主要用於基因功能缺失的遺傳病的治療。
然而，如果遺傳病不是由某個基因失去了功能導致的，而是因為這個基因由於突變獲得了某種不該有的新功能，或者增強了原來就有的舊功能，那麼“缺啥補啥”的治療思路就行不通了。對於這類疾病的治療，最根本的辦法是把出錯的基因找出來並進行糾正，使其恢復到正常的狀態，為此科學家又發明了基因編輯技術。從微觀角度看，基因編輯的過程可分為三個步驟：定位、切除、修補。
定位異常基因：基因編輯的第一步也是最重要的一步就是在DNA上找到需要進行編輯的位置。人類基因組DNA的大小在3Gb左右，在如此龐大的基因組中準確找到幾個甚至一個出錯的鹼基是非常困難的，因此需要一套精準的定位系統來快速鎖定剪下的部位。
切除異常基因片段：定位到目標位置以後，需要把錯誤的基因片段切除，這個過程主要通過內切酶來實現。目前科學家已經發現了許多種類的內切酶，也從中找到了適用於基因編輯的內切酶，如Fok I。
修補恢復成正常基因：內切酶把錯誤的基因片段切除後，會在DNA上形成一段缺口，只需要把對應的正確基因片段插入到這個缺口中並與原DNA進行連線即可完成DNA的修復。這個過程原本非常複雜，但細胞偏偏自帶這種功能。
為了維持自身DNA的穩定，在幾十億年的生物進化過程中細胞進化出了一套“DNA修復系統”，科學家則巧妙地利用生物體自帶的“DNA修復系統”實現了這個“修補”過程。
簡單地說，人體細胞的DNA是雙拷貝的，當一條DNA出現異常時，這套修復系統會以另一條同源DNA為模板，對錯誤的DNA進行修復。當人為地把外源DNA（含需要插入的基因）匯入細胞時，DNA修復系統會誤以為該外源DNA是自身同源DNA，並以此為模板對剪下後的DNA進行修復，從而實現目的基因的插入。
在整個基因編輯過程中，“準確定位”是最困難的，也是目前所有的基因編輯技術最核心的差異所在；“剪下”已經成功實現；“修補”的過程雖然複雜，但藉助於細胞自帶的DNA修復系統也基本上解決了這個問題，所以難度也不大。因此，基因編輯技術只需要完成“定位”和“剪下”這兩個步驟就行了。經過幾十年的發展，目前的基因編輯技術主要可分鋅指核酸酶技術（ZFN）、轉錄啟用樣效應因子核酸酶技術（TALEN）、成簇規律性間隔的短迴文重複序列技術（CRISPR）三大類。
1、ZFN：開基因編輯先河，操作難度和專利壟斷築就行業壁壘
鋅指核酸酶技術（ZFN）誕生於1996年，由細胞內天然存在的具有準確識別和結合特定DNA序列功能的轉錄因子衍生而來。一個鋅指核酸酶由DNA識別域和DNA剪下域兩部分組成。
DNA識別域：通常由3-4個鋅指蛋白串聯而成，每個鋅指蛋白能夠特異地識別並結合一個DNA三鹼基序列組合（由A/T/C/G四個鹼基排列而成）。因此，只要將這些特異的鋅指蛋白混合搭配，研究人員或多或少能靶定他們希望的大部分序列，從而使鋅指核酸酶能準確定位到DNA需要編輯的區域。
DNA剪下域：由核酸內切酶Fok I組成，當兩個Fok I結合到一起時就能對DNA進行剪下，因此在實際操作中鋅指核酸酶也是成對使用的，由左、右兩部分組成。基於這個原理，鋅指核酸酶成功地實現了DNA的定位和剪下，再結合外源匯入的目的基因以及細胞自帶的DNA修復系統，即可實現基因編輯。
DNA識別域對DNA的精準識別和定位是ZFN的核心，而依據目標DNA的序列將3-4個不同的的鋅指蛋白組合在一起又是重中之重。在1991年，卡爾·帕博（Carl Pabo）團隊就解析出了鋅指蛋白的三維結構，然而他們的實驗結果顯示，每個鋅指蛋白並不能精確地覆蓋其對應的三個DNA鹼基，蛋白本身還會向前後各“延長”出去一段，插足到相鄰鹼基上方，從而干擾了相鄰鋅指蛋白對DNA三鹼基序列的識別。
自然界中存在著成千上萬個鋅指蛋白，因此找到一套行之有效的篩選方法，在浩如煙海的鋅指蛋白庫中找到完美匹配的鋅指蛋白組合成為了ZFN發展和廣泛應用的技術瓶頸。1982年諾貝爾化學獎得主阿龍·克魯格（Aaron Klug）團隊利用“噬菌體展示”的方法有效地地解決了這個難題，但具體的技術細節多年來一直未能被外界所知。
與轉基因的基因治療方法相比，ZFN的主要優勢在於基因修復方式多樣、精準更換基因、對基因表達強度影響較小。
基因修復方式多樣：轉基因的治療理念是“缺啥補啥”，主要適應於基因功能缺失的遺傳病的治療；ZFN的功能更強大，可對錯誤的基因進行糾正，同時也可實現基因的插入和剔除，大大擴寬了基因治療的應用領域。
精準更換基因：ZFN存在一套精準的DNA定位系統，可對特定的DNA序列區域進行修復，不同於病毒載體隨機插入宿主基因組的方式，從而在根本上避免了因外源基因插入引起患者細胞原有基因組突變致癌的潛在風險。
對基因表達強度影響較小：ZFN實現的是基因的原位替換，對被糾正基因的表達調控元件並不會產生影響，因此就不會改變該基因的表達水平，這與病毒載體有所不同。
ZFN相比轉基因技術在基因治療方面有了質的飛躍，也拉開了基因編輯發展的序幕，但新技術的發展同樣也帶來了許多問題。
設計/篩選過程複雜：鋅指蛋白並不完全精準匹配DNA三鹼基序列，需要建立一個強大的設計和篩選平臺從龐大的鋅指蛋白庫中找出需要的鋅指蛋白組合。這個過程非常困難和繁鎖，針對不同的基因每次都需要重新走一遍流程、從頭設計特定的ZFN工具，且目前國際上僅有少數的幾個科學家掌握了其關鍵技術，這就在很大程度上限制了ZFN的臨床推廣和應用。
“可編輯性”仍然較低：鋅指蛋白已經具備了部分的“可編輯性”，從某種程度上科學家可以像玩俄羅斯方塊一樣花樣組合不同的鋅指蛋白，實現對一段特定DNA序列的準確識別，但每個鋅指蛋白對應著DNA三鹼基序列，而不是一一對應，對於基因編輯來說仍然不夠靈活。
存在脫靶風險：ZFN只通過較短的DNA片段序列（（9-12）×2個鹼基）來實現鋅指核酸酶的定位，而人類基因組DNA的大小約為3Gb，難免會在非靶基因的部位出現部分序列的重疊，導致鋅指核酸酶的錯誤定位，進而產生錯誤的基因編輯，發生脫靶效應。
細胞毒性較大：鋅指核酸酶屬於外源蛋白，匯入患者細胞後會對細胞正常的代謝功能產生一定的干擾，表現為細胞毒性。治療成本較高：ZFN的設計和篩選極其繁鎖，且針對不同的基因需要從頭設計特定的ZFN工具，導致ZFN工具的構造成本非常高，進而推高了臨床治療成本。
2、TALEN：首個真正意義上的基因“可編輯”工具
轉錄啟用樣效應因子核酸酶技術（TALEN）發明於2011年，由AvrBs3蛋白衍生而來。TALEN的工作原理與ZFN類似，核心元件的結構也類似，均由DNA識別域和DNA剪下域組成。轉錄啟用樣效應因子核酸酶通過DNA識別域結合到特定的DNA序列上，再由Fok I核酸內切酶構成的DNA剪下域對靶基因進行剪下，最後利用細胞自帶的DNA修復系統完成基因編輯。
TALEN與ZFN的區別在於DNA識別域對DNA序列的識別模式。在ZFN中，每個鋅指蛋白識別一個DNA三鹼基序列；在TALEN中，每2個氨基酸組合對應著一個特定的鹼基。因此，通過人為的刪減、新增和自由組合不同的氨基酸組合，科學家可以輕而易舉地構造出結合特定DNA序列的蛋白，從而實現轉錄啟用樣效應因子核酸酶在人類基因組DNA上的精確定位。
ZFN相比，TALEN在多個方面表現出明顯的優勢：工具蛋白設計更簡便、可編輯性高、成本降低、細胞毒性降低。
操作更靈活、設計更簡便：ZFN需要利用非常複雜的方法篩選出完美匹配的鋅指蛋白組合，整個過程費時費力，而TALEN只需要根據目標DNA序列把一個一個的2氨基酸組合串聯起來就可以解決問題。由於DNA識別機制根本上的差別，TALEN工具蛋白的設計比ZFN要簡單得多，更適於科研和臨床應用。
可編輯性高：每個鋅指蛋白對應一個DNA三鹼基序列，故而ZFN的設計類似對不同俄羅斯方塊的組合，可編輯性較差；TALEN是每2個氨基酸組合對應一個鹼基，氨基酸組可自由組合，可編輯性得到了極大的提高。
脫靶風險降低：有研究表明，在對CCR5基因進行基因編輯時，ZFN技術對CCR5基因的修正效率為14%，而對高度同源的CCR2基因的改變高達12%，與目標基因CCR5相當；TALEN技術對CCR5基因的修正效率為17%，而對CCR2基因的改變僅為1%。
細胞毒性降低：相比與ZFN的工具蛋白，TALEN所使用的蛋白對細胞的毒性也有也下降。
相對於ZFN，TALEN儘管已經有了明顯的進步，也解決了ZFN一直存在的核心難題，但還有一些缺陷：（1）TALEN的工具蛋白不能通用，針對不同的基因仍需要設計特定的轉錄啟用樣效應因子核酸酶；（2）脫靶效應導致的潛在安全風險；（3）技術使用成本仍然偏高。
3、CRISPR：當之無愧的基因編輯王者
成簇規律性間隔的短迴文重複序列技術（CRISPR）於2012年由麻省理工大學的華人科學家張峰和加州大學伯克利分校的珍妮弗獨立發明。與ZFN、TALEN相比，CRISPR系統是輕量級的基因編輯系統，其DNA定位和剪下元件由Guide RNA（gRNA）和Cas9蛋白組成。CRISPR系統發揮作用時，gRNA的crRNA部分通過鹼基互補原則結合到目標DNA上；藉助於gRNA，Cas9蛋白也順利識別並結合到需要剪下的DNA部位，再發揮其DNA剪下活性，使DNA的目標位點產生缺口，進而利用細胞自帶的DNA修復系統和外源基因實現基因編輯。
根據核心蛋白元件以及用途的不同，目前CRISPR系統可分為2大類、6小類，共19個亞型，其中研究最多、進展最快、應用最廣的是第二大類中的II型（CRISPR/Cas9）和V型（CRISPR/Cpf1），用於DNA的基因編輯。
與CRISPR/Cas9系統相比，CRISPR/Cpf1系統具有多方面的優勢：（1）系統結構更簡單：Cpf1蛋白在功能上比Cas9蛋白更整合，分子量也更小，更容易進入細胞，提高基因編輯效率；同時Cpf1蛋白只需要一個RNA分子協助（Cas9至少需要2個）；（2）DNA剪下方式更優：Cpf1蛋白剪下DNA後會產生黏性末端，便於新DNA序列插入；（3）DNA剪下位置不同：Cpf1蛋白在DNA上的剪下位點離識別位點很遠，可編輯位置的選擇餘地更大；（4）Cpf1蛋白不同的識別序列令其基因編輯效果更好；（5）CRISPR/Cas9有一定的脫靶率，而CRISPR/Cpf1幾乎不脫靶；（6）Cpf1在多基因編輯上更有優勢。
與ZFN和TALEN相比，CRISPR系統的優勢主要體現在系統設計簡便、可實現多基因編輯等。
系統設計簡便、易於操作：以CRISPR/Cas9為例，發揮DNA剪下功能的Cas9元件是通用的，因此只需要根據靶基因的不同設計相應的gRNA即可，其設計難度和複雜度遠低於ZFN和TALEN，大大拓展了CRISPR系統的應用前景。
可實現多基因編輯：在ZFN和TALEN系統中，每次基因編輯只能實現一個基因的改造，而CRISPR系統則突破了這個限制，可通過在一套CRISPR系統中新增多個gRNA來實現多基因編輯，為多基因遺傳病的治療提供了可能。
此外，CRISPR還具有基因編輯效率更高、脫靶風險低、操作成本低等多方面的優勢。然而，CRISPR技術出現時間還太短，科學家還無法充分預估其潛在風險。
可能因人體免疫反應而失效：2018年1月，斯坦福大學兒科血液學家Matthew Porteus和Kenneth Weinberg領導的研究小組發表論文，發現在70%的人中都發現了Cas9同源蛋白的抗體，而超過一半的人都存在其同源物的抗原特異性T細胞，這意味著CRISPR/Cas9系統進入人體後可能被人體自身的免疫系統清除而失效，甚至有可能會引發人體劇烈的免疫反應。
至於人體自帶Cas9抗體的原因，科學家推測Cas9蛋白來源於細菌，可能在人類進化過程中產生了相應的抗體作為保護機制。因此，要解決這個問題，可能需要對Cas9蛋白進行修飾而避免人體的免疫反應，或者從不存在於人體的微生物中繼續尋找其他代替Cas9的酶。另一方面，也有不少科學家對論文結論的可靠性提出了質疑，CRISPR/Cas9的結局如何還需要等待科學界最後的評判。
仍可能存在脫靶風險：CRISPR/Cpf1雖然相對於CRISPR/Cas9在脫靶的問題上已經有了明顯的改善，但仍不可避免地存在未知的脫靶風險，相關技術的安全性也需要進一步考察。
ZFN因為專利壟斷、操作複雜等原因，TALEN和CRISPR則因為技術出現時間太短，基因編輯技術面世20年後仍未在臨床上大規模地應用。綜合比較，TALEN和CRISPR無疑比ZFN更有優勢；僅TALEN和CRISPR而言，二者各有優缺點，都屬於相對容易操作的基因編輯系統，CRISPR暫時不會完全取代TALEN在臨床上的作用。但長期來看，CRISPR更便捷，隨著其切割元件的不斷優化，CRISPR系統的優勢將進一步加大，未來基因編輯仍是CRISPR的天下。
三、治療模式：“體外”、“體內”各有所長
目前基因治療的模式主要有兩種：“離體”治療和“體內”治療。
（一）“離體”治療：技術難度偏小，可實現程度更高
“離體”治療的操作物件是從病人身上分離的細胞，根據細胞型別的不同可分為兩大類：造血幹細胞、T淋巴細胞等血液細胞和其他型別的細胞。（1）血液細胞：收集分離病人血液中特定型別的細胞後，利用基因改造的方式對細胞錯誤的基因進行修復或使其獲得新的功能，再輸回病人血液中，實現疾病的治療。（2）其他型別的細胞：以遺傳性大皰性表皮鬆解症為例，治療時獲取病人小塊的面板，對面板細胞基因改造後，利用細胞自身的增殖能力，體外培養出較大的面板組織，再移植到病人身上，實現疾病的治療。
與“體內”治療相比，“離體”治療的優勢主要表現在技術難度較小、對載體的要求較低、安全性更高等幾個方面。
技術難度較小：體外基因改造的技術方法已經較為成熟，臨床上也產生了一些成功的案例。
對載體的要求較低：體外培養環境對病毒等載體的容忍度要遠高於體內苛刻的環境，因此對於載體的靶向性、免疫原性等要求都大幅降低。
安全性更高：在體外對細胞基因修飾後，可作進一步的篩選，從中找到優質的細胞對病人進行治療，降低安全風險。
然而，“離體”治療也存在很大的侷限性，主要表現為候選細胞種類有限、難以長期保持移植細胞功效等。
候選細胞種類有限：通過獲取細胞、體外改造培養的方式，只能產生細胞型別單一的組織，細胞難以自發形成有功能、組成複雜、形態多樣的組織和器官，因此較大程度上限制了“離體”治療的應用範圍。由於血液細胞通常是離散的單個細胞，不像其他組織器官那樣是由多種型別的細胞按照特定的規律聚集組成，故而“離體”治療方案更適用於血液細胞相關疾病的基因治療。
難以長期保持移植細胞功效：部分細胞（如T細胞）的增殖能力有限且有一定的生存週期，改造的細胞回輸病人體內後會逐步喪失增殖能力，逐漸死亡而消失，無法使病人獲得長期的治療效果。
綜合“離體”治療的優缺點，目前“離體”治療主要還是集中於對T細胞和造血幹細胞的改造上。此外，在部分特殊疾病的治療上也取得了一些進展，如2015年德國波鴻大學醫院的醫生通過基因編輯的方法成功地對一名遺傳性大皰性表皮鬆解症患者進行了治療，並取得良好的效果。
（二）“體內”治療：應用前景廣闊，技術要求更高
“體內”治療操作時只需要把攜帶目的基因的載體注入病變部位即可，理論上可以實現任意種類細胞的基因改造，不再像“離體”治療那樣受到細胞種類的限制，這是“體內”治療相對“離體”治療最大的優勢，但在技術上真正實現任意細胞的基因改造目前還有一定難度。此外，“體內”治療也省去了“離體”治療的細胞收集、基因改造、培養擴增等繁瑣的操作。
“體內”治療的侷限性主要在於載體要求高、安全風險大等，因此技術難度高於“離體”治療。
載體要求高：攜帶目的基因的載體（如逆轉錄病毒）對於患者來說是外源性的，故而載體進入人體後會受免疫系統的排斥，使治療效果打折扣；同時，目前大部分載體靶向性並不好，對組織和細胞型別沒有選擇性，要實現把目的基因遞送到特定細胞中，現階段常用的方法是體內定點注射載體，以期讓載體在空間上儘可能地聚集在靶細胞附近。因此，選擇合適的載體以緩解免疫排斥和靶向性等帶來的問題是“體內”治療最關鍵的要素之一。
安全風險大：相對於“離體”治療，“體內”治療在載體的細胞靶向性、基因靶向性等方面都還需要進一步改進，容易對正常細胞產生誤操作，且無法通過篩選剔除誤傷的細胞，故而比“離體”治療風險更大。
“體內”治療的靶組織和器官型別相對分散，目前主要在神經系統疾病、血友病、肌肉疾病、視網膜病變等疾病的治療上取得了一些成效。
四、基因治療的行業現狀：轉基因仍是主流，基因編輯潛力巨大
（一）多因素助力基因治療取得成功
基因治療的爆發始於20世紀90年代初期，現在再回頭看當時那些基因治療的成功案例，或多或少都帶有一些運氣的成分。經過近30年科學技術的發展，基因治療越來越成熟，成功率也不斷提高，主要得益於幾個方面的因素：
（1）病毒載體的改進提高了治療的有效性和安全性，如目前應用最廣的慢病毒載體和腺相關病毒載體；
（2）載體制備和鑑定技術的發展使載體的純度和效力都有了較大幅度的提升，既提高了細胞轉染的成功率，同時也降低了不良反應的發生率；
（3）基礎的生物學知識儲備不斷增加，使得科學家對靶細胞、組織和器官的瞭解也愈發深入，能更準確地預見基因治療能帶來的效果和副作用，提前做好應對方案；
（4）更細緻的臨床觀察、更有效的分子監測也幫助科學家用更確切的證據去把握基因治療的療效和安全性；
（5）受到1999年美國男孩死亡事件的影響，2000年以後科學家對基因治療臨床試驗的開展更加謹慎，對臨床試驗方案的設計也做了改進，比如招募只表現出早期症狀的患者參加試驗，而不是進展至疾病晚期的患者，這也在一定程度上提高了臨床試驗的成功率。
（二）技術和人才是行業最大的壁壘
儘管目前基因治療在部分領域取得了一些進展，但仍有不少亟待解決的問題。基因治療技術上的難點主要是如何提高有效性以及降低安全風險。和許多新興技術一樣，能夠解決行業痛點的關鍵技術和人才是基因治療行業目前最大的壁壘。
對於基於轉基因技術的基因治療來說，現階段遇到的技術瓶頸主要是（1）病毒載體多缺乏靶向性，並不能特異性地感染病變細胞，即使不同亞型的腺相關病毒對某些組織具有部分選擇性，但也遠達不到特異識別的程度，因此進行“體內”治療時，目前只能通過區域性定點注射的方式，限制了臨床應用範圍；
（2）目前臨床上廣泛使用的逆轉錄病毒和慢病毒在感染宿主細胞後會把自身的基因組插入宿主細胞的基因組中，其插入的位置是隨機的，存在引起插入突變及細胞惡性轉化的潛在危險；腺相關病毒雖然屬於非整合型病毒，但仍存在插入宿主基因組的可能性；
（3）理想的基因治療應能根據病變的性質和嚴重程度不同，調控治療基因以適當的水平或方式表達，但現有的基因匯入系統載體容量有限，不能包容全基因或完整的調控順序，從而只能借用病毒自帶的基因表達調控元件，導致目的基因的表達量無法調控，也不能達到正常生理狀態下的表達水平；
（4）病毒載體具有一定的毒性和免疫原性，注入患者體內後容易被人體的免疫系統所清除，同時也帶來副作用；
（5）病毒載體的基因匯入效率仍有進一步提升的空間。對於基於基因編輯技術的基因治療來說，關鍵的技術難點主要是（1）基因編輯技術，特別是CRISPR技術面世的時間還太短，存在太多不確定的因素，再加上科學家對人類基因功能和調控網路的認知還非常不足，輕易改動基因可能引發無法預見的安全問題；（2）基因編輯系統匯入細胞的效率和基因編輯的效率都還不高，尚無法真正實現臨床上的大規模應用；（3）基因編輯系統與病毒載體一樣也不具有細胞靶向性。
無論轉基因技術還是基因編輯技術，要解決當前臨床應用面臨的技術難題，對載體和系統進行優化升級都是最直接、最有效也是無法迴避的方式。此外，基因治療多為個體化的治療方案，真正實現商業化還需要做出較大的優化和改進。除了技術上的瓶頸，基因治療還存在專利壁壘和倫理糾紛等非技術障礙。
（四）基因治療的臨床應用：重點佈局腫瘤和遺傳病
1、CAR-T：“離體”基因治療目前最成功的應用
CAR-T治療（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受體T細胞免疫治療）是“離體”基因治療目前在臨床上最成功的應用。CAR-T技術現階段主要用於血液腫瘤的治療，主要代表是FDA於2017年批准的Kymriah（諾華）和Yescarta（Kite）兩款產品；實體腫瘤的治療尚屬於探索階段，還需要等待技術上出現革命性的突破。病人接受CAR-T治療時，科學家先從病人的外周血中分離得到T細胞，再利用慢病毒等載體將人工改造的目的基因匯入T細胞，使T細胞轉變成CAR-T細胞，從而獲得了特異性識別並殺傷腫瘤細胞的能力；待CAR-T細胞擴大培養至一定數量後，再回輸給病人，實現腫瘤的治療。
以白血病為例，傳統的化療和放療在臨床上已經使用了幾十年，對大部分的白血病有效，療效和副作用都相對明確，故而現階段仍是臨床上首選的治療方案，但化療和放療對一部分病人的治療效果並不理想。因此，CAR-T的意義在於給這些傳統療法無效的患者提供新的治療方案，並且多個CAR-T產品均已在臨床上取得了非常好的治療效果。然而，白血病只是CAR-T臨床應用的起點，且目前CAR-T尚作為三線治療方案，未來隨著技術的不斷改進和成熟，CAR-T技術有望在除白血病之外的其他血液腫瘤乃至實體腫瘤的治療上取得突破，這將徹底改變目前腫瘤治療的格局，擁有很大的成長空間。
2、地中海貧血：基因治療有望顛覆現有治療方案
地中海貧血即珠蛋白生成障礙性貧血，患者通常表現出常見的貧血狀態以及相應的併發症，其致病機制是珠蛋白基因缺陷使血紅蛋白中的珠蛋白肽鏈有一種或幾種合成減少或不能合成，導致血紅蛋白的組成成分改變，進而引發紅細胞壽命縮短，表現為慢性溶血性貧血。地中海貧血屬於常染色體隱性基因遺傳病，當夫妻雙方均為致病基因的攜帶者時，其後代有25%的概率會患病，50%的概率為致病基因攜帶者，25%的概率基因完全正常。
針對地中海貧血，目前臨床上常規的治療方案是定期輸血，患者需要終身治療，治療費用昂貴，且容易產生輸血副反應；根治方案是進行造血幹細胞移植，將健康人的造血幹細胞植入病人體內，可實現疾病的治癒，但最大的障礙是造血幹細胞配型非常困難，即使配型成功，多數病人接受治療後仍需長期服用免疫抑制性藥物。
最有前景的治療方案是基因治療，從病人的外周血中收集造血幹細胞後，利用病毒載體將正常的珠蛋白基因匯入其中，使細胞功能恢復正常，再將改造後的造血幹細胞回輸給病人。造血幹細胞來源於病人自身，因此不存在配型和排斥的問題。改造的造血幹細胞進入病人體內後，會源源不斷地產生功能正常的新的紅細胞，從而達到緩解甚至治癒疾病的目的。
綜合比較，目前臨床上地中海貧血的治療方案都存在諸多缺陷，而基因治療則在很大程度上填補了這個臨床未滿足需求，待技術進一步成熟後，有望在臨床上迅速得到推廣，進而取代目前並不完美的治療方案。
3、鐮刀型細胞貧血：基因編輯或將抹除自然選擇的“印跡”
鐮刀型細胞貧血是一種常染色體隱性基因遺傳病，主要見於非洲黑人，也見於中東、希臘、土籍印第安人及與上述民族長期通婚的人群。正常的紅細胞呈圓餅狀，而患者的紅細胞呈鐮刀狀，其攜帶氧的功能只有正常紅細胞的一半。患者出生半年後症狀逐漸出現，除了表現出貧血的相關症狀外，臨床上患者還常伴有生長髮育遲緩、骨骼發育異常等表現。
鐮刀型細胞貧血的病理在於β-珠蛋白基因發生單鹼基突變，改變了β-珠蛋白的氨基酸序列，導致血紅蛋白溶解度下降，進而形成管狀凝膠結構，引起紅細胞扭曲成鐮刀狀。由於形態異常，鐮刀型紅細胞易在細微血管分支處聚集，造成血管阻塞，嚴重者甚至死亡。
目前鐮刀型細胞貧血尚無法治癒，臨床上採用的治療方案多隻能緩解症狀，如輸血、造血幹細胞移植等，而基因治療有望對鐮刀型細胞貧血進行根治。不同於地中海貧血轉基因的治療方案，鐮刀型細胞貧血需要對患者自身錯誤的基因進行糾正，故而在採集病人的造血幹細胞後，可利用基因編輯技術，把突變的基因變回正常的基因，使造血幹細胞的功能得到恢復，再將改造後的造血幹細胞回輸給病人，實現疾病的治療。
4、艾滋病：從偶然醫療事件到基因治療
艾滋病又稱獲得性免疫缺陷綜合徵，由人免疫缺陷病毒（HIV）感染引起。HIV進入人體後，主要攻擊CD4陽性的T淋巴細胞，破壞人體的免疫系統，最終患者多因免疫系統崩潰而罹患腫瘤或受其他病原體感染致死。研究發現，HIV感染T細胞需要由細胞表面的多種蛋白共同介導，因此阻斷這些蛋白與HIV的識別有望治癒艾滋病。
科學家曾偶然發現一名艾滋病患者在接受骨髓移植後其體內的HIV消失了，這意味著這名患者的艾滋病被骨髓移植治癒了。進一步研究發現，其骨髓捐獻者天然攜帶CCR5△32這種基因變異，而該基因原型CCR5是介導HIV感染T細胞的關鍵蛋白之一，這種基因突變阻斷了HIV感染T細胞的途徑，使T細胞獲得了抵抗HIV的特殊能力。因此，通過基因編輯的方式，將患者造血幹細胞的CCR5基因替換成CCR5△32，即可使患者新生成的T細胞獲得抵抗HIV的能力，再輔以抗病毒藥物的治療，有望實現艾滋病的治癒。該技術成熟以後，將徹底終結目前“談艾色變”的局面。
5、血友病：基因治療讓“外傷出血”不再可怕
常見的血友病（A型和B型血友病）是X染色體連鎖的隱性基因遺傳病。患者因凝血因子基因缺陷導致凝血功能障礙，臨床表現為終身輕微外傷即發生長時間出血。凝血因子有很多種，每種凝血因子均在凝血的過程中發揮重要作用，不同凝血因子基因的缺陷會產生不同型別的血友病，臨床均表現為凝血障礙。
目前臨床上血友病的治療方案主要是替代治療，即給患者注射其血液中缺少的凝血因子。這種治療方案的缺陷很明顯，不能治癒、需要終身治療，治療費用非常昂貴。基因治療的思路非常明確——缺啥補啥，只需要利用轉基因的方式給患者自身的細胞補充其缺失的凝血因子基因即可。凝血因子主要由肝細胞產生，因此血友病基因治療的操作物件是患者的肝細胞。不同於地中海貧血和鐮刀型細胞貧血的治療，“離體”基因治療方案在血友病中行不通，只能採取體內治療的方式。通過原位注射將攜帶正常基因的病毒載體注入肝組織中，病毒載體再把正常基因匯入肝細胞，實現基因的補償，治癒血友病。
6、溶瘤病毒：從“惡魔”到“天使”的華麗變身
溶瘤病毒是基因治療在腫瘤治療上的另一個應用。通過基因改造，科學家賦予了傳統病毒全新的功能：（1）溶瘤病毒感染腫瘤細胞後能大量增殖並使腫瘤細胞發生裂解，但在正常細胞中溶瘤病毒的增殖受到限制，降低了副作用；（2）改造後的溶瘤病毒攜帶某些能抑制腫瘤細胞分裂的基因，當病毒感染腫瘤細胞後會抑制腫瘤細胞增殖，從而實現腫瘤的控制；（3）某些改造後的溶瘤病毒具有腫瘤細胞靶向性，進一步提高了腫瘤殺傷效果，降低了副作用。溶瘤病毒是目前眾多腫瘤治療方案的一部分，技術成熟後有望單獨使用或和其他治療方案聯合使用，提高腫瘤的可治癒性。
國內醫藥企業也緊跟國際技術發展前沿，目前有幾百家公司開展與基因治療相關的業務，主要集中在東部沿海一帶。雖然基因治療在國內如火如荼地開展，但與國外還有不小的差距，我們認為這個現象是中國醫藥生物的科研和技術水平長期落後於國外導致的，不僅僅只是基因治療這一個領域。從全球範圍來看，基因治療在經歷了10多年的行業大整改之後剛剛進入快速發展的階段，國內外的差距要小於其他傳統醫藥領域，國內企業仍擁有後來居上的潛力。