bowtie和bowtie2用法詳解
bowtie 短序列比對工具詳解
常見的短序列比對工具有很多，如fasta、blast、bowtie、shrimp、soap等。每個工具都有其自身的優點，但同時也具備了一些缺點。權衡利弊，我選擇bowtie作為主要的短序列比對工具。它速度很快，比對結果也容易理解。
現在舉個例子來探討bowtie的使用方法：現在有GENOME.fa、高通量測序資料Reads.fa，我們希望將Reads.fa比對到基因組GENOME.fa上。
（一）、對Reference檔案(GENOME.fa)建庫
1、bowtie-build GENOME.fa GENOME.fa
建庫步驟可能需要1h甚至幾個小時，建議在後臺執行：
nohup bowtie-build GENOME.fa GENOME.fa &
（二）、將Reads.fa比對到GENOME.fa上，只能比對到正鏈，且匹配到基因組不多於20個不同位置，允許有1個錯配（引數見下）
| 1 |
bowtie -f -a -m 20 -v 1 --al Reads_aligned --un Reads_unaligned --norc GENOME.fa Reads.fa Reads.bwt 2> log |
- 注：
- -f 指定query檔案為fasta格式
- -a 保留所有比對結果
- -m 指定最大比對到基因組的次數
- -v 允許最大錯配數，為[0-2]
- --al 能map到GENOME的reads，fasta格式
- --un 不能map到GENOME的reads，fasta格式
- --norc 不輸出匹配到負鏈的結果；如果不想輸出比對到正鏈的結果，則用"--nofw"。不指定該選項則正負鏈結果都輸出
- 後面依次寫上GENOME索引檔案，Reads檔案，輸出結果檔案Reads.bwt，日誌檔案log。
- --best、--strata參考 https://www.plob.org/article/932.html
（三）、bowtie輸出結果的說明
| 1 |
sample001_x75 + Chr1 12453 ATCGGCCAATTACGGACTTAA IIIIIIIIIIIIIIIIIIIII 4 9:G>T |
- 1. query id
- 2. "+"表示正向match；"-"表示對query作反向互補後match
- 3. reference id
- 4. 第2列為"+"時，表示query 第一個鹼基map到reference(5'->3')上的位置，0-based(以0開始)；第2列為"-"時，表示query的反向互補序列第一 個鹼基map到reference(5'->3')上的位置，0-based(以0開始)
- 5. 如果第2列為"+"，則和query序列一致；否則，和query序列反向互補
- 6. 質量檔案，如果query檔案為fasta格式，則無法獲取質量檔案，用I代替，I的數量與query序列長度一致
- 7. 當前query能map到GENOME的4個不同位置
- 8. 如果存在第8列，表示有mismatch。第8列可以分為三個部分，最左端的數字，中間的鹼基為reference鹼基，最右端的鹼基為query鹼基，下面分情況討論：
- 第2列為"+"時：最左端的數字9表示query從5'端數起，第10個鹼基為"T"，而對應的reference為"G";
第2列為"-"時：最左端的數字9表示query先作反向互補，然後從3'端數起，第10個鹼基為"T"，而對應的reference為"G";
原文連結：http://blog.sina.com.cn/s/blog_4b91a9e50101mmqi.html
bowtie2 短序列比對工具詳解
懶人必看
對參考序列構建index
bowtie2-build genome.fasta index
嘗試使用前10000個reads進行比對
bowtie2 -u 10000 -p 8 -x index -1reads1.fq -2 reads2.fq -S out.sam
使用8個執行緒進行比對
bowtie2 -p 8 -x index -1 reads1.fq -2reads2.fq -S out.sam
比對的sam結果中添加了read group資訊
bowtie2 -p 8 --rg-id sample01 --rg"PL:ILLUMINA" --rg "SM:sample01" -x index -1 reads1.fq -2reads2.fq -S out.sam
常用的引數進行比對，可以更改其中的引數獲得更好的結果
bowtie2 -q --phred33 --sensitive--end-to-end -I 0 -X 500 --fr --un unpaired --al aligned --un-conc unconc --al-concalconc -p 6 --reorder -x <bt2-idx> {-1 <m1gt; -2 <m2> | -U<r>} -S [<hit>]
用法：
bowtie2 [options]* -x <bt2-idx> {-1<m1> -2 <m2> | -U <r>} -S [<hit>]
bowtie2-build用法
bowtie2-build預設情況下將fasta檔案換成index的資料庫。
bowtie2-build <fasta檔案> <要生成的索引檔案字首名>
必須引數：
-x <bt2-idx>由bowtie2-build所生成的索引檔案的字首。首先 在當前目錄搜尋，然後在環境變數BOWTIE2_INDEXES中制定的資料夾中搜尋。
-1 <m1>雙末端測尋對應的檔案1。可以為多個檔案，並用逗號分開；多個檔案必須和-2<m2>中制定的檔案一一對應。比如:"-1flyA_1.fq,flyB_1.fq -2 flyA_2.fq,flyB
_2.fq".測序檔案中的reads的長度可以不一樣。
-2 <m2>雙末端測尋對應的檔案2.
-U <r>非雙末端測尋對應的檔案。可以為多個檔案，並用逗號分開。測序檔案中的reads的長度可以不一樣。
-S <hit>所生成的SAM格式的檔案字首。預設是輸入到標準輸出。
以下是可選引數：
輸入引數
-q輸入的檔案為FASTQ格式檔案，此項為預設值。
-qseq輸入的檔案為QSEQ格式檔案。
-f 輸入的檔案為FASTA格式檔案。選擇此項時，表示--ignore-quals也被選擇了。
-r輸入的檔案中，每一行代表一條序列，沒有序列名和測序質量等。選擇此項時，表示--ignore-quals也被選擇了。
-c後直接為比對的reads序列，而不是包含序列的檔名。序列間用逗號隔開。選擇此項時，表示—ignore-quals也被選擇了。
-s/--skip <int> input的reads中，跳過前<int>個reads或者pairs。
-u/--qupto <int>只比對前<int>個reads或者pairs（在跳過前<int>個reads或者pairs後）。Default: no limit.
-5/--trim5 <int>剪掉5'端<int>長度的鹼基，再用於比對。(default:0).
-3/--trim3 <int>剪掉3'端<int>長度的鹼基，再用於比對。(default:0).
--phred33輸入的鹼基質量等於ASCII碼值加上33.在最近的illuminapipiline中得以運用。最低鹼基質量是“#”。
--phred64輸入的鹼基質量等於ASCII碼值加上64.最低鹼基質量是“B”。
--solexa-quals將Solexa的鹼基質量轉換為Phred。在老的GAPipeline版本中得以運用。Default: off.
--int-quals輸入檔案中的鹼基質量為用“”分隔的數值，而不是ASCII碼。比如40 4030 40...。Default: off.
–end-to-end模式下的預設引數
--very-fast Same as: -D 5 -R 1 -N 0 -L 22-i S,0,2.50
--fast Same as: -D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -iS,0,2.50
--sensitive Same as: -D 15 -R 2 -N 0 -L 22-i S,1,1.15 (default in --end-to-endmode)
--very-sensitive Same as: -D 20 -R 3 -N 0-L 20 -i S,1,0.50
–loca模式下的預設引數
--very-fast-local Same as: -D 5 -R 1 -N 0-L 25 -i S,1,2.00
--fast-local Same as: -D 10 -R 2 -N 0 -L 22-i S,1,1.75
--sensitive-local Same as: -D 15 -R 2 -N 0-L 20 -i S,1,0.75 (default in --local mode)
--very-sensitive-local Same as: -D 20 -R 3-N 0 -L 20 -i S,1,0.50
比對引數：
-N <int>進行種子比對時允許的mismatch數.可以設為0或者1.Default:0.
-L <int>設定種子的長度.
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功能選項
給bowtie的一些引數設定值的時候，使用一個計算公式代替，於是值的大小與比對序列的長
度成一定關係。<func>有三部分組成: (a)計算方法,包括常數(C),線性(L),平方根(S)和
自然對數(G); (b)一個常數; (c)一個係數.
例如:
<func>為L,-0.4,-0.6則計算公式為: f(x)= -0.4 + -0.6 * x
<func> 為G,1,5.4則計算公式為: f(x)= 1.0 + 5.4 * ln(x)
************************************************************
-i <func>設定兩個相鄰種子間所間距的鹼基數。
************************************************************
例如：如果read的長度為30,種子的長度為10,相鄰種子的間距為6,則提取出的種子如下
所示：
Read: TAGCTACGCTCTACGCTATCATGCATAAAC
Seed 1 fw: TAGCTACGCT
Seed 1 rc: AGCGTAGCTA
Seed 2 fw: CGCTCTACGC
Seed 2 rc: GCGTAGAGCG
Seed 3 fw: ACGCTATCAT
Seed 3 rc: ATGATAGCGT
Seed 4 fw: TCATGCATAA
Seed 4 rc: TTATGCATGA
************************************************************
在--end-to-end模式中預設值為”-iS,1,1.15”.即表示f(x) = 1 + 1.15 *sqrt(x).如果read長度為100,則相鄰種子的間距為12.
--n-ceil <func>設定read中允許含有不確定鹼基(非GTAC,通常為N)的最大數目.Default: L,0,0.15.計算公式為: f(x) =0 + 0.15 * x,表示長度為100的read最多執行存在15個不確定鹼基.一旦不確定鹼基數超過15,則該條read會被過濾掉.
--dpad <int> Default: 15.
--gbar <int>在read頭尾<int>個鹼基內不允許gap.Default: 4.
--ignore-quals計算錯配罰分的時候不考慮鹼基質量.當輸入序列的模式為-f, -r或者-c的時候,該設定自動成為預設設定.
--nofw/--norc –nofw設定read不和前導鏈(forwardreference strand)進行比對;
--norc設定不和後隨鏈(reverse-complementreference strand)進行比對.
Default: both strands enabled.
--end-to-end比對是將整個read和參考序列進行比對.該模式--ma的值為0.該模式為預設模式, --local模式衝突.
--local該模式下對read進行區域性比對,從而, read兩端的一些鹼基不比對，從而使比對得分滿足要求.該模式下 –ma預設為2.
得分罰分引數
--ma <int>設定匹配得分.--local模式下每個read上鹼基和參考序列上鹼基匹配,則加<int>分.在—end-to-end模式中無效. Default: 2.
--mp MX,MN設定錯配罰分.其中MX為所罰最高分, MN為所罰最低分.預設設定下罰分與鹼基質量相關.罰分遵循的公式為: MN + floor( (MX-MN)(MIN(Q, 40.0)/40.0) ).其中Q為鹼基的質量值.如果設定了—ignore-qual引數,則錯配總是罰最高分. Default:MX = 6, MN = 2.
--np <int>當匹配位點中read,reference上有不確定鹼基(比如N)時所設定的罰分值.Default: 1.
--rdg <int1>,<int2>設定在read上開啟gap罰分<int1>,延長gap罰分<int2>.Default: 5, 3.
--rfg <int1>,<int2>設定在reference上開啟gap罰分<int1>,延長gap罰分<int2>. Default: 5, 3.
--score-min <func>設定成為有效比對的最小分值.在—end-to-end模式下預設值為:L,-0.6,-0.6;在--local模式下預設值為:G,20,8.
報告引數
-k <int>預設設定下,bowtie2搜尋出了一個read不同的比對結果,並報告其中最好的比對結果(如果好幾個最好的比對結果得分一致,則隨機挑選出其中一個).而在該模式下,bowtie2最多搜尋出一個read<int>個比對結果,並將這些結果按得分降序報告出來.
-a和-k引數一樣,不過不限制搜尋的結果數目.並將所有的比對結果都按降序報告出來.此引數和-k引數衝突.值得注意的是:如果基因組含有很多重複序列時,該引數會導致程式
執行極其緩慢.
Effort引數
-D <int>比對時,將一個種子延長後得到比對結果,如果不產生更好的或次好的比對結果,則該次比對失敗.當失敗次數連續達到<int>次後,則該條read比對結束. Bowtie2才會繼續進行下去. Default: 15.當具有-k或-a引數,則該引數所產生的限制會自動調整.
-R <int>如果一個read所生成的種子在參考序列上匹配位點過多.當每個種子平均匹配超過300個位置,則通過一個不同的偏移來重新生成種子進行比對. <int>則是重新生成種子
的次數. Default: 2.
Paired-end引數
-I/--minins <int> 設定最小的插入片段長度.Default: 0.
-X/--maxins <int> 設定最長的插入片段長度.Default: 500.
--fr/--rf/--ff 設定上下游reads和前導鏈paired-end比對的方向. --fr: 匹配時，read1在5'端上游, 和前導鏈一致, read2在3'下游, 和前導鏈反向互補. 或者read2在上游, read1在下游反向互補; --rf: read1在5'端上游, 和前導鏈反向互補, read2在3'端下游, 和前導鏈一致; --ff:兩條reads都和前導鏈一致. Default: --fr. 預設設定適合於Illumina的paired-end測序資料; 若是mate-paired, 則要選擇—rf引數.
--no-mixed 預設設定下, 一對reads不能成對比對到參考序列上,則單獨對每個read進行比對. 該選項則阻止此行為.
--no-discordant 預設設定下, 一對reads不能和諧比對(concordantalignment,即滿足-I, -X, --fr/--rf/--ff的條件)到參考序列上, 則搜尋其不和諧比對(disconcordant alignment, 即兩條reads都能獨一無二地比對到參考序列上, 但是不滿足-I,-X,--fr/--rf/--ff的條件). 該選項阻止此行為.
--dovetail read1和read2的關係為dovetail的時候,該狀況算為和諧比對. 預設情況下dovetail不算和諧比對.
--no-contain read1和read2的關係為包含的時候, 該狀況不算為和諧比對. 預設情況下包含關係算為和諧比對.
--no-overlap read1和read2的關係為有重疊的時候, 該狀況不算為和諧比對. 預設情況下兩個reads重疊算為和諧比對.
輸出引數
-t/--time --un <path> 將unpaired reads寫入到<path>.
--un-gz <path> 將unpairedreads寫入到<path>, gzip壓縮.
--un-bz2 <path> 將unpairedreads寫入到<path>, bz2壓縮.
--al <path> 將至少能比對1次以上的unpairedreads寫入<path>.
--al-gz <path> ... ,gzip壓縮.
--al-bz2 <path> ... ,bz2壓縮.
--un-conc <path> 將不能和諧比對的paired-endreads寫入<path>.
--un-conc-gz <path> ... ,gzip壓縮.
--un-conc-bz2 <path> ... ,bz2壓縮.
--al-conc <path> 將至少能和諧比對一次以上的paired-endreads寫入<path>.
--al-conc-gz <path> ... ,gzip壓縮.
--al-conc-bz2 <path>... ,bz2壓縮.
--quiet 安靜模式,除了比對錯誤和一些嚴重的錯誤, 不在螢幕上輸出任何東西.
--met-file <path> 將bowtie2的檢測資訊(metrics)寫入檔案<path>.用於debug.Default: metrics disabled.
--met-stderr <path> 將bowtie2的檢測資訊(metrics)寫入標準錯誤檔案控制代碼. 和上一個選項不衝突. Default: metrics disabled.
--met <int> 每隔<int>秒寫入一次metrics記錄. Default:1.
Sam 引數
--no-unal不記錄沒比對上的reads.
--no-hd不記錄SAM header lines (以@開頭).
--no-sq不記錄@SQ的SAM headerlines.
--rg-id <text>設定read groupID為text。在SAM檔案的頭中增加一行@RG，在輸出的SAM檔案中新增Tag "RG:Z:text"。
--rg <text>使用text作為@RG的一列，比如"SM:Pool1"。在@RG中加入多列，則多次使用該引數即可。在進行Variant calling的過程中需要@RG頭，SM資訊和Tag RG。
效能引數
-o/--offrate <int> 無視index的offrate值, 以<int>取代之. Index預設的<int>值為5. <int>值必須大於index的offrate值, 同時<int>越大, 耗時越長，耗記憶體越少.
-p/--threads NTHREADS 設定執行緒數.Default: 1
--reorder 多執行緒運算時, 比對結果在順序上會和檔案中reads的順序不一致, 使用該選項, 則使其一致.
--mm 使用記憶體定位的I/O來載入index, 而不是常規的檔案I/O. 從而使多個bowtie程式共用記憶體中同樣的index, 節約記憶體消耗.
其它引數：
--qc-filter 濾除QSEQ fileter filed為非0的reads. 僅當有—qseq選項時有效.Default: off.
--seed <int>使用<int>作為隨機數產生的種子.Default: 0.
--version列印程式版本並退出
-h/--help 列印用法資訊並推出