〖生物技術〗單細胞測序方法大比拼

• 測序技術

在單細胞研究的大潮中，新的測序方法層出不窮。不過，很少有人對這些方法進行系統的比對。慕尼黑大學生物學家Wolfgang Enard最近領導團隊，在小鼠胚胎幹細胞的基因表達研究中比較了一些常用的單細胞測序方法，包括Smart-seq、CEL-seq、SCRB-seq和Drop-seq。

SMART（Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript）是一個具有里程碑意義的重要技術。實際上，能夠從單細胞生成全長cDNA的測序方案並不多，Smart-seq就是其中之一。對於等位基因特異性表達或者剪接變體研究來說，覆蓋整個轉錄組是一件非常重要的事情。

Fluidigm C1單細胞製備系統能夠自動完成Smart-seq步驟。你只需要將製備好的細胞懸液加進去，儀器就會分離並裂解細胞，把mRNA逆轉錄為cDNA，再對cDNA進行擴增。擴增後的cDNA可以拿來測序，也可以進行qPCR檢測。

在Enard的比較研究中，Fluidigm C1系統的Smart-seq最為靈敏，成本也最高。這一系統使用的微流體晶片不能重複使用，不過這種晶片可以放到顯微鏡下觀察，證實健康單細胞的存在。

CEL-seq（Cell expression by linear amplification and sequencing）是一種採用線性擴增的常用測序方法。線性擴增的主要優勢是錯誤率比較低，不過線性擴增和PCR都存在序列依賴性偏好。

CEL-seq技術發表於2012年，主要是分離單細胞，逆轉錄帶有poly-A 尾巴的mRNA片段，給它們貼上代表其細胞來源的條碼。2014年Science雜誌釋出的MARS-seq與CEL-seq很類似。

CEL-seq和其他線性擴增方法生成文庫花費的時間要稍微長一點。不過，CEL-seq在早期階段就給樣本貼上條碼並進行混合，大大減少了手動操作的時間。PCR是在最後階段使用的，主要是為了連線正確的測序接頭，CEL-seq開發者紐約大學的Itai Yanai介紹到。

CEL-seq所需試劑都是現成的，大約兩天時間生成測序文庫和測序資料，Yanai指出。需要注意的是，CEL-seq與大多數方案一樣，測序轉錄本的3’端。Enard等人並沒有親自嘗試著一技術，只是在比較研究中用到了CEL-seq資料。從這項研究來看，CEL-seq的重現性最好。

GitHub網站提供有CEL-seq可用的生物資訊學工具。Yanai研究團隊正在開發新版本CEL-seq2，新版本的靈敏度將比舊版本高三倍。

Broad研究所開發的SCRB-seq（single-cell RNA barcoding and sequencing）技術採用的是PCR擴增。該技術需要結合流式細胞儀（FACS）或者其他細胞分選方法，把單細胞分配到微孔裡去。

SCRB-seq與Smart-seq比較相似，只不過SCRB-seq會整合特異性的細胞條碼，以分辨擴增分子的來源，更準確的定量轉錄本。此外，SCRB-seq並不生成全長cDNA，而是像CEL-seq一樣富集RNA 3’端。

2014年，開發者們將SCRB-seq技術提前釋出在BioRXiv上。隨後他們對這一技術進行了更新，並將其更名為“high-throughput eukaryote 3’ digital gene expression”。Broad研究所仍提供有SCRB-seq技術服務，SCRB-seq也被整合到了Wafer GenBio systems公司的scRNA-seq平臺上。據說Fluidigm公司的C1系統很快也將支援SCRB-seq方案。SCRB-seq目前是Enard最中意的測序方法，它不僅適用於單細胞RNA測序，還能支援大量細胞（bulk）的RNA測序。可惜的是SCRB-seq並不好DIY，研究者自己很難將測序流程與FACS對接起來。

哈佛醫學院的研究人員開發了以微滴為基礎的兩種獨立技術Drop-seq和inDrop。他們利用微流體裝置將帶有條碼的微珠和細胞一起裝入微小的液滴，建立了快速、廉價、高通量的單細胞RNA-seq方法。這兩種技術將細胞隔離在微小的液滴中，裝上用於擴增的條碼引物，由此檢測數以千計的細胞。研究者們認為，Drop-seq和inDrop能夠幫助生物學家進一步發現和分類人體細胞，繪製大腦等複雜組織的細胞多樣性圖譜，更好地瞭解幹細胞分化，獲得更多疾病的遺傳學資訊。

Enard及其同事發現，Drop-seq在單個細胞中檢測的基因數還不到Smart-seq/C1、CEL-seq和SCRB-seq的一半。不過，在統計學水平上研究差異性表達的時候，高通量Drop-seq和SCRB-seq是最划算的。哈佛醫學院Steve McCarroll實驗室去年下半年根據使用者反饋，在自己網站上公佈了3.1版的Drop-seq（mccarrolllab.com/dropseq）。

參與開發SCRB-seq的Stefan Semrau正在搭建自己的Drop-seq平臺。Semrau從Whitehead生物醫學研究所搬到Leiden物理研究所的時候，發現自己用FACS已經不那麼方便了，於是他為新實驗室選擇了Drop-seq。建立微流體晶片和液滴系統是整個過程中最艱難的部分，不過Semrau實驗室的一名微流體博士後僅用三週就搞定了這些問題。Drop-seq文庫製備是任何分子生物學研究者都熟悉的標準操作。據Semrau估計，搭建和優化Drop-seq大概只需要六個月時間。

四種單細胞RNA-seq方法比較