揭祕差異基因功能富集分析
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通過差異分析，我們可以知道不同分組間是否存在差異，存在差異的是哪些基因。再進一步，需要探究這些基因的表達量出現差異是由哪些生物學過程介導的，我們的實驗處理影響了哪些生物學過程。
為了探究上述問題，我們首先需要知道基因參與的生物學過程，這個依賴於我們對生命活動的已有認知，比如常見的KEGG資料庫，就儲存了基因對應的通路資訊。其次，我們還需要一點統計學手段，差異基因的數目是成百上千的，每個基因又參與多個生物學過程，直接將所有差異基因的功能彙總，會得到非常多的資訊，由於數量龐大，所以看起來是雜亂無章的，沒有任何規律可言，所以需要藉助統計學手段，去挖掘差異基因集中在哪些生物學過程，也就是我們常說的富集分析。
從上面的解釋可以看到，富集分析有兩個核心
1. 基因的註釋資訊
基因參與的生物學過程，也稱之為基因的功能註釋，這部分資訊主要依賴已有的資料庫，常見的資料庫包括GO, KEGG, wikipathway, reactome等。
需要注意的是，不同資料庫覆蓋的基因數目是不一樣的，以human為例，一共2萬多個蛋白編碼基因 ， 其中有KEGG pathway註釋的只有6000多個。由於已有認知的缺陷，這個是無法避免的問題，只能通過不斷的探索研究來更新和完善資料庫中的內容。
所以在富集分析時，會集合多個數據庫來分析，最常見的就是GO和KEGG資料庫，近年來reactome用的也越來越多。其實，只要是你感興趣的功能資料庫，都可以拿來做分析。
2. 統計方法
如何研究差異基因集中參與的生物學過程，需要藉助統計學手段，常見的方法包括以下兩種：
- 費舍爾精確檢驗
- GSEA
費舍爾精確檢驗的核心就是得到如下所以的2X2的表格，
| DGE | Genome | |
|---|---|---|
| in pathway | 19 | 40 |
| not in pathway | 281 | 6800 |
從兩個角度將基因進行分類，是否為差異基因，是否位於待研究的通路上，就可以得到上述表格了。第一列之和為差異基因的總數，第二列之和為非差異基因的總數。
在用這種方式進行分析時，通常會選擇一個log2FD的閾值，挑選顯著差異的基因，這種一刀切的過濾手段去除了一些可能的關鍵基因，其次，如果你的差異基因沒有對應的pathway註釋，那麼在富集分析時，會被直接丟掉，以上兩點是這種方法的缺陷。
GSEA又稱之為基因集富集分析，這裡的基因集指的就是資料庫中的基因集合，比如pathway中的某條通路對應的所有基因，所以這種方法的研究物件和費舍爾精確檢驗是一致的。唯一不同的是，它的輸入是所有基因，首先對基因進行排序，然後分析排序後的基因列表在某個通路下是否富集。
由於該方法不需要對基因事先過濾，所以不會丟掉某些差異基因，能夠挖掘出的資訊量也會增加，近年來也是越來越受歡迎。
在後續文章中，會詳細介紹不同工具的使用方法。