基因組測序資料的拼接/組裝 （圖片來源：google）    

每一個物種的參考基因組序列（reference genome）的產生都要先通過測序的方法，獲得基因組的測序讀段（reads），然後再進行從頭拼接或組裝（英文名稱為do novo genome assembly），最後還原測序物種的各條染色體的序列，即ATGC四種鹼基的排列順序。

 

之所以要進行基因組拼接，是因為現在的測序技術還只能測較短的序列，無法直接獲取一整條染色體的序列。如一代測序（Sanger測序）一般可測1kb左右的序列；二代測序（next-generation sequencing），一般可測50~500bp；三代測序雖然可測100kb甚至更長的序列，但現在三代測序技術還不是很成熟，還有較高的測序錯誤率。（歡迎關注微信公眾號：AIPuFuBio，和使用生物資訊學平臺AIPuFu：www.aipufu.com）

 

基因組測序資料的從頭組裝過程，可簡單描述為：reads---->contig---->scaffold---->chromosome，具體如下所示：

基因組序列從頭組裝示意圖（圖片來源：Guo et al. Genomics, 2017）。   首先基因組測序產生reads，然後對reads進行組裝產生長片段Contigs，再確定Contig的方向和順序，組裝產生更長的片段Scaffolds，最後再組裝連線Scaffold得到完整的染色體序列。

 

接下來，給大家依次介紹一下上圖從頭拼接中涉及到的兩個概念：contig和scaffold。

Contig是由多個reads通過組裝而形成的長片段。由於測序讀段較短、基因組序列通常含有較多重複序列、而且還有測序錯誤等原因，除了簡單的基因組序列外，大部分物種的基因組序列組裝都會先產生很多contig，無法一次獲得完整的染色體序列。

Scaffold為多條contig序列連線形成更長片段，這些contig方向和順序已經確定，且contig間未知序列（一般用NNNN表示）的長度也獲知。

 

Scaffold的獲得一般主要通過雙端測序（如paired-end sequecing或mate-pair sequencing）來確定contig的順序和方向，以及contig之間的間隔距離，具體如下示意圖所示。

由reads組裝產生contig，再由contig連線形成scaffold的示意圖 （圖片來源：google）  

 

基因組測序資料的從頭組裝的核心演算法主要可以分為以下幾大類：

1、基於貪心演算法（greedy-extention）；

2、基於Overlap-Layout-Consensus（OLC）；

3、基於de Bruijn Graph；

4、以上兩種或多種演算法的組合；

5、其他型別。

 

具體如下圖所示：

基因組從頭組裝演算法分類及代表性軟體發表的時間（圖片來源：Zhanget al. PlosOne, 2011）

其中最經典的兩類為：

1）Overlap-Layout-Consensus（OLC）演算法，基於OLC演算法的組裝軟體主要是針對長測序讀段（如Sanger測序、454測序等）設計的；

2）de Bruijn Graph演算法，基於de Bruijn Graph的組裝軟體則主要是針對二代測序產生的短讀段資料設計。

 

具體如下所示：

1）Overlap-Layout-Consensus（OLC）演算法

Overlap-Layout-Consensus（OLC）演算法的示意圖（圖片來源：Ayling et al. Briefings in Bioinformatics, 2019）

 

2）de Bruijn Graph演算法

de Bruijn Graph演算法的示意圖（圖片來源：Ayling et al. Briefings in Bioinformatics, 2019）

 

現在主流的是二代測序技術，因此再給大家詳細介紹一下專門針對二代測序資料開發的基於de Bruijn Graph的從頭拼接方法。

 

其中一個非常著名的軟體就是Velvet，是基於de Bruijn Graph設計的經典代表，其演算法示意圖如下：

Velvet從頭組裝軟體的演算法設計示意圖（ 圖片來源：Zerbinoet al. 2008, Genome Research）。其中紅色鹼基為測序錯誤或SNP位點。

 

Velvet的組裝原理，主要可分為這幾個步驟：

1）首先把所有測序讀段（reads）都分割為更小的片段k-mer；

Reads產生k-mer的過程示意圖。這裡k為7，假如read的長度為n，則總共可產生n-1個k-mer。

2）把每個k-mer作為一個節點，然後判斷k-mer之間是否有k-1鹼基的重疊，如果有則作為兩個不同的節點連線起來。依次這樣連線所有可連線的k-mer就形成了Velvet從頭組裝軟體演算法設計示意圖中第2步的de Bruijn Graph；

3）依次合併相鄰的k-mer，因為相鄰的k-mer有k-1個鹼基的重疊，就可進一步簡化de Bruijn Graph形成Velvet從頭組裝軟體演算法設計示意圖中第3步的簡化後的圖；

4）使用一系列演算法消除由測序錯誤而形成的tips（具體如Velvet從頭組裝軟體的演算法設計示意圖中所示），併合並bubbles（兩條或多條路徑序列，一般由SNP造成，如Velvet從頭組裝軟體的演算法設計示意圖）；

5）最後拼接得到Contig序列。

 

值得注意的是，Velvet從頭組裝軟體演算法設計示意圖中最後一步拼接產生了迴文序列，主要是由於原始序列中含有迴文，如果k取為偶數（圖中k=4）就容易在組裝中形成這種現象。

為了有效的避免拼接中產生迴文序列，一般k取為奇數。

 

那麼基於基因組測序資料的從頭拼接軟體，那些具有較好的效能呢？

不同從頭組裝軟體在拼接C.elegans、Yeast、E.coli、Swinepox基因組時的準確性和覆蓋度比較（ 圖片來源：Zhanget al. PlosOne, 2011）

 

從上圖中可以看出，Velvet和SOAPdenovo在拼接C.elegans、Yeast、E.coli、Swinepox的基因組序列時，相對於其他軟體，組裝結果更準確（A：Percentage of correctly mapped contigs）且拼接出來的序列能更完整的覆蓋原基因組序列（B：Genome Coverage）。

 

大部分處理測序資料的軟體都是由國外開發的，其中這裡提到的SOAPdenovo為華大基因開發的從頭拼接軟體。

 

​今天就給大家介紹到這裡。更多精彩，可見大型免費綜合生物資訊學資源和工具平臺AIPuFu：www.aipufu.com，關注微信公眾號：AIPuFuBio。

 

希望今天的內容對大家有用，會持續更新經典內容，歡迎留言~~！

&n